曹小宇，黄佳奇，陈美琳，王鹏龙，王苗苗，韩爱庆，杨恩华，巩文桥，吴嘉瑞#

(1.北京中医药大学中药学院，北京 102488；2.北京中医药大学管理学院，北京 102488；3.鲁南制药集团股份有限公司医学部，山东 临沂 276003)

荨麻疹为临床上常见的过敏性皮肤病，是由肥大细胞介导的局限性水肿反应[1]。临床治疗荨麻疹以抗组胺药为首选，但患者长期服用化学药易产生耐药性，不良反应大，停药后易复发。因此，研究中药治疗荨麻疹具有重大意义。荨麻疹在中医学中被称为“瘾疹”等。中医认为，荨麻疹的主要诱因为素体虚弱，风邪侵袭，肺胃不固，脾虚生湿，邪气郁于肌肤之腠理，邪正相搏[2]。荆防颗粒方中荆芥、防风具有祛风之功效，柴胡疏肝敛阴，茯苓健脾化湿，诸药合用祛风胜湿、疏肝健脾，治疗荨麻疹有良好的效果[3]。本研究旨在探讨荆防颗粒治疗荨麻疹的作用机制，为进一步的实验研究提供理论依据，也为中医药治疗荨麻疹提供思路与线索。

1 资料与方法

1.1 荆防颗粒重要化合物收集及靶点预测

通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，http://tmspw.com/)，分别以“荆芥”“防风”“羌活”“独活”“柴胡”“前胡”“川芎”“枳壳”“茯苓”“桔梗”和“甘草”为关键词进行检索。根据口服生物利用度(OB)和化合物类药性(DL)，设置阈值OB≥30%，DL≥0.18，筛选出符合条件的成分作为重要化合物并得到其相关的靶标蛋白。通过Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)查询靶标蛋白对应的基因名。

1.2 荨麻疹相关靶点筛选

以“Urticaria”为关键词，分别在GeneCards(https://genecards.org)、人类孟德尔遗传综合数据库(OMIM，https://omim.org)和DrugBank数据库(https://go.drugbank.com)中检索荨麻疹疾病靶点。

1.3 网络图构建

应用Cytoscape 3.7.2软件构建荆防颗粒药物-化合物-靶点网络。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建

利用在线工具Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)，将荆防颗粒靶点蛋白和荨麻疹疾病靶点进行交集，得到两者的共有靶点。将所得交集靶点录入STRING网站(https://string-db.org/)得到其PPI网络。

1.5 富集分析

利用R x64 4.1.1软件对交集靶点基因进行基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析，并进行可视化。

1.6 分子对接

通过TCMSP数据库下载荆防颗粒关键成分的mol2格式结构，在RCSB PDB数据库(https://www.rcsb.org/)中下载靶蛋白的pdb格式文件。使用Notepad++软件删除蛋白链中的水分子、原小分子配体等。将小分子mol2格式文件上传至Autodock Tools-1.5.6，对其进行加电荷，设置可旋转键等处理，并保存为PDBQT格式配体。将处理好的靶蛋白pdb文件上传至Autodock Tools-1.5.6，对其进行加氢、加电荷等处理。使用Autodock Vina1.1.2进行分子对接。最后，使用Pymol软件将对接结果进行可视化。

2 结果

2.1 重要化合物筛选

通过TCMSP数据库初步检索得到荆防颗粒重要化合物共187个。通过Uniprot数据库检索重要化合物相对应的人类基因共同靶点共261个。

2.2 药物-成分-靶点相互作用网络

药物-成分-靶点网络共428个节点，3 172条边，见图1。度值表示网络中和节点相连的路线条数，度值较大的节点在网络中起枢纽作用，其中对应基因靶点最多的5个化合物，即度值最高的依次为MOL000098—槲皮素、MOL000358—β-谷甾醇、MOL000422—山柰酚、MOL000006—芦丁和MOL004328—柑桔素。各边表示化合物和靶点间的相互作用关系。

正方形代表药物；六边形代表化合物；菱形代表靶点；游离的六边形代表药物的共同化合物，化合物度值由小到大，六边形大小由小到大the squares represent the drugs；the hexagons represent compounds；the diamonds represent the targets；the free hexagons represent common compounds of the drug,according to the degree of the compounds from small to large,and the size of the hexagon from small to large图1 药物-成分-靶点相互作用网络Fig 1 Drug-component-target network

2.3 荨麻疹相关疾病靶点预测

以“Urticaria”为关键词在DrugBank数据库检索到疾病相关靶点63个，在GeneCards数据库检索到相关疾病靶点528个，在OMIM检索到疾病靶点13个，合并去除重复值，得到荨麻疹疾病相关靶点共556个。

2.4 构建药物-化合物-靶基因-疾病网络

利用韦恩图展示化合物和疾病共有靶点关系，见图2。得到荆防颗粒治疗荨麻疹潜在基因75个，利用Cytoscape 3.7.2软件构建化合物-疾病靶点网络图，见图3。网络中共225个节点，927条边。其中对应基因靶点最多的5个化合物，即度值最高的依次为MOL000098—槲皮素、MOL000006—芦丁、MOL000422—山柰酚、MOL000358—β-谷甾醇和MOL000173—汉黄芩素。

图2 韦恩图Fig 2 Venn diagram

正方形代表药物；六边形代表化合物；菱形表示化合物和疾病共有靶点；游离的六边形代表药物的共有化合物the squares represent the drugs；the hexagons represent compounds；the diamonds represent the common targets of compounds and diseases；the free hexagons represent common compounds of the drug图3 化合物-疾病靶点网络图Fig 3 Compound-disease network

2.5 构建PPI网络

将共有靶点导入STRING网站进行分析，利用Cytoscape 3.7.2构建PPI网络图，见图4。网络中共75个节点，1 018条边；节点颜色越深代表度值越大。

由内到外代表其度值由大到小from inside to outside represents its degree from large to small图4 PPI网络Fig 4 Protein protein interaction network

2.6 核心基因的生物学过程及通路分析

GO功能富集分析共得到1 391个条目，其中与生物过程(BP)相关条目1 307条，主要涉及丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性调控(regulation of protein serine/threonine kinase activity)、细胞黏附调控(regulation of cell-cell adhesion)等；与细胞组分(CC)相关条目20条，主要涉及细胞膜膜阀(membranw raft)、细胞膜微结构域(membrane microdomain)等；与分子功能(MF)相关条目64条，涉及细胞因子受体结合(cytokine receptor binding)、受体配体活性(receptor ligand activity)等。展示各自前10条显著条目，表明荆防颗粒的重要化合物可能通过参与多种生物调控过程发挥治疗荨麻疹的作用，见图5。

图5 GO功能富集分析Fig 5 GO enrichment analysis

KEGG通路富集分析结果可提示荆防颗粒治疗荨麻疹可能作用的通路，富集分析共得到211个条目，展示前30条显著的通路，P值排序靠前的通路主要有磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、人类巨细胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)和糖尿病并发症中的晚期糖基化终末产物(AGE)-AGE受体信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)等，见图6。将PI3K-Akt信号通路和JAK激酶-信号转导及转录激活因子(JAK-STAT)信号通路进行可视化展示，见图7—8。

图6 KEGG通路富集分析Fig 6 KEGG pathway enrichment analysis

图8 JAK-STAT信号通路Fig 8 JAK-STAT signaling pathway

2.7 中药-成分-靶点—通路互相作用网络图

筛选KEGG通路富集分析结果，得到6条P值较高的通路，将荆防颗粒和成分、成分和靶点、通路和靶点的相互关系数据导入CytoScape 3.7.2软件中，得到中药-成分-靶点-通路相互作用网络图，见图9。

六边形代表荆防颗粒；八边形代表荆防颗粒重要化合物；平行四边形代表荆防颗粒治疗荨麻疹的候选靶点；矩形代表靶点相关通路the hexagon represents Jingfang granules；the octagons represent the important compounds of Jingfang granules；the parallelograms represent the candidate targets of Jingfang granules in the treatment of urticaria；the rectangles represent the target-related pathways图9 中药-成分-靶点-通路相互作用网络Fig 9 Traditional Chinese medicine-component-target-pathway network

2.8 分子对接

用AutoDockTools软件对部分关键靶点和度值较高的化合物进行分子对接，结合能<20.93 kJ/mol表示具有较好的结合活性，可知槲皮素(quercetin)与基质金属蛋白酶9(MMP9)、血管内皮生长因子A(VEGFA)，乙酸亚油醇酯(linoleyl acetate)与前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2),山柰酚(kaempferol)与Akt1均有较好活性，见图10。

A.乙酸亚油醇酯与PTGS2的分子对接；B.山柰酚与Akt1的分子对接；C.槲皮素与MMP9的分子对接；D.槲皮素与VEGFA的分子对接A.molecular docking of linoleyl acetate and PTGS2；B.molecular docking of kaempferol and Akt1；C.molecular docking of quercetin and MMP9；D.molecular docking of quercetin and VEGFA图10 分子对接结果Fig 10 Molecular docking result

3 讨论

本研究通过靶点预测、网络构建和分子对接等方法，进行荆防颗粒治疗荨麻疹作用机制的预测和阐释。通过靶点预测得到261个潜在靶点，其中度值较高的3个重要化合物为槲皮素、芦丁和山柰酚，均为黄酮类成分。黄酮类化合物具有抗氧化、降血脂、降血压、抗肿瘤和抗炎活性[4-5]。槲皮素可通过血清免疫球蛋白E(IgE)高亲和力受体(FcεRIα)交联，抑制肥大细胞系HMC-1分泌内胰蛋白酶和白细胞介素(IL)6，下调其组氨酸脱羧酶(HDC)mRNA转录，减少组胺的释放[6]；还可通过调控PI3K-Akt信号通路下调炎症因子IL-1β、肿瘤坏死因子(TNF)的表达，发挥抗炎作用[7]。芦丁具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤和降血压等多种活性，通过调控丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)和核因子κB(NF-κB)通路抑制NO和环氧合酶2(COX-2)的产生，从而达到抗氧化应激、抗炎的作用[4]。山柰酚对氧化应激、炎症、肿瘤、糖尿病和内皮功能障碍等具有治疗作用，通过抑制NF-κB介导的信号通路，减弱炎症因子的表达，进而抑制肥大细胞的炎症反应，还可以用于治疗肥胖、心血管疾病等[3,8-9]。

通过对“中药-成分-靶点-通路相互作用网络图”分析，认为FAS配体、IL-6、TNF、Akt1和肿瘤蛋白p53(TP53)可能为荆防颗粒治疗荨麻疹的关键靶点，所述靶点多涉及炎症反应、免疫调节和血管通透性的调节。研究结果发现，在免疫应答过程中，IL-6作为关键免疫因子，可调节多种细胞的生长与分化，并在机体的抗感染免疫反应中起重要作用[10]。IL-6为重要的促炎因子，可以刺激肥大细胞表面Toll样受体4(TLR4)表达，释放细胞因子IL-4，IL-4对多种免疫细胞均有调节作用，因此，IL-6可通过对TLR4的上调以及IL-4的释放加重炎症反应[11-12]。也有研究结果表明，Akt1基因的缺失会导致血管内皮生长因子诱导的血管生成，从而增加伤口、炎症反应以及血管通透性[3]。同时，PI3K-Akt是介导荨麻疹发病的通路之一，Akt1是该通路的分子之一[13]。可通过降低Akt1的表达水平来抑制PI3K通路，进而对荨麻疹起到治疗作用。

GO功能富集结果表明，主要涉及丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性调控、细胞黏附调控、细胞膜膜阀、细胞膜微结构域、细胞因子受体结合和受体配体活性等，表明荆防颗粒重要化合物可能通过参与多种生物调控过程发挥治疗荨麻疹的作用，主要涉及细胞增殖、分化、代谢、凋亡以及免疫应答与炎症反应[14]。KEGG通路富集分析结果显示，主要富集的通路有PI3K-Akt信号通路、人类巨细胞病毒感染、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、Jak-STAT信号通路、膀胱癌、疟疾、TNF信号通路和胰腺癌等。其中，PI3K-Akt信号通路参与调控巨噬细胞炎症反应，因此，抑制该通路可以治疗荨麻疹等炎症疾病[15]。JAK-STAT信号通路可传导多种信号，研究结果表明，通过抑制JAK-STAT信号通路的激活，进而抑制小胶质细胞向M1型(促炎)极化，可缓解炎症反应[16-17]。

综上所述，本研究通过网络药理学方法，明确荆防颗粒中有效化学成分在治疗荨麻疹的过程中具有抗炎、免疫调节和调节血管通透性等作用，揭示了其潜在的药理学机制，说明荆防颗粒是基于多成分、多靶点、多通路的特点相互协同治疗荨麻疹，为进一步的实验研究提供了理论依据，也为中医药治疗荨麻疹提供了线索和思路。