杨 慧，李 钢，淮瑞平，杨丹妮，雷利杰，欧阳艳，熊莉丽

西南交通大学生命科学与工程学院，成都 610031

黄连(CoptischinensisFranch.)属于毛茛科、黄连属，在《本草纲目》中记载：黄连具有清热燥湿，泻火解毒之效[1]。黄连属植物约有18种，我国产6种，分别是黄连、三角叶黄连、云南黄连、峨眉黄连、五叶黄连、五裂黄连，一个变种：短萼黄连，以上前三种习称为“味连”“雅连”和“云连”。四川是黄连的主要产地之一，《名医别录》记载：“黄连生巫阳及蜀郡大山，二月八月采”[2]。早在明代以前，四川峨眉地区就开始人工栽培黄连，目前四川峨眉地区就有GAP味连种植基地。传统中药黄连水煎液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等体外抑菌效果显著[3]。黄连及其有效成分的抗菌机理是复杂多样的，包括破坏细菌细胞膜、抑制胞内大分子物质的合成、阻断细菌分裂和发育、干扰Z环的形成以抑制细胞分裂蛋白FtsZ[4]。

内生菌是指栖息在植物器官中的细菌或真菌，能够在植物内部组织中定居，且不会对宿主造成明显的伤害。植物内生菌是重要的生物活性产物的新来源[5]。有学者从松果属植物Conocarpuserecta中分离到内生真菌Cytosporasp.，在其发酵液中筛选出新型抗菌化合物cytosporone D，对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、大肠杆菌以及白色念珠菌抑菌效果显著[6]。日益严峻的抗生素耐药性已经对人类健康构成重大威胁[7]，发掘药用植物内生真菌资源是寻找新型抗菌药物的新途径之一[8]。

四川作为黄连主产地之一，目前对川黄连内生真菌多样性的相关研究仍为空白，同时对于黄连内生真菌代谢产物的抑菌活性和机制也未见有研究。目前已有的黄连内生菌研究集中于分离菌株代谢产物中的单体化合物[9,10]以及筛选产小檗碱的黄连内生真菌[11,12]。药用植物内生菌多样性及内生菌代谢产物的进一步研究等方面均具有深入研究的意义和价值，因此本研究依托于川黄连的产地优势，探究四川地区黄连内生真菌的多样性，进一步研究其代谢产物抑菌机制，为黄连内生真菌资源的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

基因扩增仪A200(杭州朗基科学)；真菌基因组DNA快速抽提试剂盒(上海生工)；Inspect扫描电子显微镜(美国FEI)；E-1045离子溅射装置(日立高新技术那珂事务所)。

1.2 植物材料

黄连采自四川省乐山市峨眉山市，经鉴定为一株五年生味连(CoptischinensisFranch.)。

1.3 供试菌株

金黄色葡萄球菌ATCC25923(Staphylococcusaureus)；大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)来自四川省人民医院/四川省医学科学院检验科。

1.4 黄连内生真菌分离纯化

将采集到的新鲜黄连洗净后对完整枝段及须根部分进行表面消毒后切成0.5 cm×0.5 cm的组织块，接种到加入青链霉素的PDA平板上，正置28 ℃培养[13]。设置对照实验组验证表面消毒程序有效及操作环境洁净。培养5～7天后，采用菌丝尖端接种法进行纯化，保存于4 ℃冰箱。记录分离黄连组织块数目，按如下公式计算植株内生真菌定殖率。

内生真菌定殖率=

(分离菌株数目/分离组织块数目)×100%

1.5 内生真菌鉴定

形态学鉴定包括菌落形态特征描述及菌丝、孢子形态的观察。采用载玻片湿室培养法观察，经乳酸酚棉蓝染色液染色固定后在光学显微镜下观察菌丝及孢子形态。参考真菌分类学相关书籍[14]，对分离到的真菌进行初步分类。

分子生物学鉴定即采用内部转录间隔区(Internal Transcribed Spacer，ITS)测序的方法，利用测序数据建立系统发育树，鉴定其亲缘关系[15]。提取真菌DNA，选择引物ITS5/ITS4(北京擎科生物科技有限公司合成)，ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)；ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)[16]。PCR条件：98 ℃预变性30 s；98 ℃变性10 s，57.3 ℃退火5 s，72 ℃延伸4 s，28个循环；72 ℃终延伸1 min。序列数据经处理后与NCBI数据库Blast比对，采用邻接法构建进化树，自展值5 000，对内生真菌的种属关系进行分类，如若进化树待测序列的自展支持值>90%，则基本认定为此种。

1.6 内生真菌抗菌性筛选

活化金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌，采用平板稀释法测定菌落数目，稀释菌液浓度为1×106CFU/mL。内生真菌抗菌性筛选采用打孔法[17]：在LB培养基上均匀涂布菌液，用7 mm打孔器在平板中央打去琼脂块，再将黄连内生真菌平板上最外缘打取菌块接种至涂布好菌液的LB固体平板上，每组设置3个平行，37 ℃培养，游标卡尺十字交叉法测量抑菌圈大小。

1.7 内生真菌发酵产物抑菌活性

“1.6”初筛到的抑菌菌株Cop S01、Cop L01、Cop FR01进一步扩大发酵收集代谢产物。活化后接种于40 mL PDB培养基后，28 ℃摇床180 r/min，7天后进一步扩大培养体积至1 200 mL，菌丝菌液分离，二氯甲烷萃取菌液，收集有机相旋蒸后称量产物质量，甲醇溶解后备用。抑菌活性检测采用纸片扩散法[18]，S.aureus作为受试菌株，菌液浓度为1×106CFU/mL，均匀涂布于LB平板，将Cop S01、Cop L01、Cop FR01发酵产物用甲醇充分溶解后制成30%的溶液，将无菌纸片放入无菌平皿内，在每张纸片上缓缓滴加20 μL发酵产物，使其全部吸收，每组设置3个平行。将含有发酵产物及空白对照的纸片用无菌镊子分别置于LB平板上，将平板正置于4 ℃冰箱过夜，后转入37 ℃恒温培养箱中培养18～20 h后观察实验结果。

1.8 Cop L01发酵产物抑菌机制初探

Cop L01发酵产物MIC、MBC值的测定：10 mL LB培养基中加入100 μL浓度为1×106CFU/mLS.aureus菌液，稀释产物浓度梯度为0、2、4、6、8、10、11、12 mg/mL，37 ℃ 200 r/min培养。观察各个梯度浓度下菌液的浑浊度，肉眼不可见浑浊的最低浓度即为MIC。取100 μL平板涂布后培养观察记录，每组设置3个平行。若该浓度下平板无菌落生长，则该浓度为MBC值。

S.aureus生长曲线及给药前后胞外大分子物质含量测定：将浓度为1×106CFU/mL菌液取100 μL加入10 mL LB培养基中，实验组加入10 mg/mL Cop L01发酵产物，37 ℃ 200 r/min振荡培养18 h，每2 h取样，测量对照组、实验组OD600 nm，绘制生长曲线。测定加入发酵产物对S.aureus细胞膜完整性的影响：核酸与蛋白质在OD260 nm和OD280 nm下有最大吸收值，因此在0～18 h内检测在该波长下的紫外吸光值可以估测胞外核酸和蛋白含量变化[19]。

扫描电子显微镜检测Cop L01发酵产物对S.aureus形态的影响。收集生长至对数期的S.aureus细胞用3%戊二醛悬浮固定细菌，用无菌水漂洗2次，用梯度浓度乙醇脱水处理样品。最后加入100%酒精重悬后，离子溅射喷镀后电镜下观察[20]。

2 结果与分析

2.1 内生真菌鉴定结果

实验从黄连中分离到94株内生真菌，经纯化去重后得到14株黄连内生真菌，以分离植株拉丁名和分离部位进行编号如下表1。根状茎部位内生真菌定殖率是27.8%，茎部位内生真菌定殖率是56.7%，叶部位内生真菌定殖率是52.5%，须根部位内生真菌定殖率是39.6%。

表1 黄连内生真菌分离纯化结果

纯化后的黄连内生真菌经传统的形态学鉴定如图1所示。提取真菌基因组DNA后扩增ITS序列，将扩增成功的PCR产物送样测序(北京擎科生物科技有限公司)。绘制黄连内生真菌系统发育树如图2。共鉴定菌株14株，来自5目、7科、11属、11个种，同时将测序数据上传至NCBI数据库，得到相应序列号。菌种鉴定结果如表2。

图1 黄连内生真菌菌落形态及显微形态图Fig.1 Morphology and microscopic morphology of endophytes in C.chinensis注：A～N对应菌种编号Cop R01～07、Cop S01～04、Cop L01、Cop FR01～02。A1～N1为菌种菌落，A2～N2为菌丝、孢子形态。Note:A-N correspond to Cop R01-07,Cop S01-04,Cop L01,Cop FR01-02.A1-N1 are fungal colonies,A2-N2 are mycelium and spore morphology.

图2 基于ITS rDNA序列的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on ITS rDNA sequences

表2 黄连内生真菌ITS鉴定结果

2.2 内生真菌抗菌性结果

黄连内生真菌抗菌性结果如下表3所示。实验结果表明所有黄连内生真菌对S.aureus均具有抑菌作用，且Cop S01、Cop L01、Cop FR01对S.aureus有非常显著的抑菌活性，它们的抑菌环大小超过了35 mm，他们分别属于Cercosporasp.、Colletotrichumsp.、Colletotrichumsp.。

2.3 内生真菌发酵产物抑菌结果

富集Cop S01、Cop L01、Cop FR01发酵产物质量分别为738.7、472.8、446.4 mg。纸片扩散法测得黄连内生真菌发酵产物结果如下图3所示。Cop S01、Cop L01、Cop FR01均对S.aureus有显著抑菌作用，其中Cop L01抑菌效果极其显著，抑菌圈超过20 mm。

表3 纯化得到的14株黄连内生真菌抗菌性结果

图3 Cop S01、Cop L01、Cop FR01代谢产物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果图Fig.3 Antibacterial effect of Cop S01,Cop L01 and Cop FR01 metabolites on S.aureus注：与空白对照组比较，**P < 0.01；****P < 0.000 1。Note:Compared with control,**P < 0.01;****P < 0.000 1.

2.4 Cop L01代谢产物抑菌机制初探

测定Cop L01发酵产物MIC、MBC值。培养18～24 h后，10 mg/mL浓度菌液澄清无浑浊，判定该浓度下Cop L01发酵产物能够极大程度地抑制S.aureus的生长，因此Cop L01发酵产物MIC值为10 mg/mL。如图4所示，随着给药浓度不断加大，平板上菌落数不断减少，10 mg/mL浓度下平板上菌落数减少至可数，11 mg/mL和12 mg/mL浓度下平板上无菌落数，因此Cop L01发酵产物MBC值为11 mg/mL。

图4 Cop L01发酵产物MIC和MBC值测定Fig.4 Cop L01 fermentation product MIC and MBC value determination注：a～h分别对应浓度0、2、4、6、8、10、11、12 mg/mL。Note:a-h correspond to concentrations of 0,2,4,6,8,10,11,12 mg/mL.

如图5所示，Cop L01发酵产物在MIC浓度下明显抑制金黄色葡萄球菌生长，表现为加入发酵产物后即发挥抑菌作用。如图6所示，随着培养时间延长，OD260 nm和OD280 nm数值均较对照组有明显升高，胞外蛋白及核酸含量均有上升。说明培养时间越长，金黄色葡萄球菌细胞壁细胞膜完整性受到影响，细胞内容物逐渐外泄，引起胞外大分子含量上升。

图5 Cop L01发酵产物与S.aureus生长曲线Fig.5 Cop L01 fermentation product and S.aureus growth curve

扫描电子显微镜结果如图7示，对照组细菌形态完整，呈现葡萄串状，表面光滑；加入MIC浓度Cop L01发酵产物培养16～18 h后，金黄色葡萄球菌表面出现明显粗糙，细胞间出现黏连，细胞凹陷破裂，细菌数量明显减少，菌体形态较正常S.aureus有显著变化。

图6 Cop L01发酵产物对S.aureus核酸、蛋白泄漏的影响Fig.6 Effects of Cop L01 fermentation products on S.aureus nucleic acid and protein leakage注：a为核酸泄漏情况；b为蛋白质泄漏情况。Note:a is nucleic acid leakage;b is protein leakage.

图7 Cop L01发酵产物MIC浓度培养对S.aureus细胞形态的影响Fig.7 The effect of MIC of Cop L01 fermentation product on S.aureus morphology注：a：正常生长S.aureus细胞形态；b：加入发酵产物培养后S.aureus细胞形态,标尺4 μm。Note:a:Normal growth S.aureus cell morphology;b:S.aureus cell morphology after fermentation product.scale bar 4 μm.

3 结论

本研究从川黄连植株根状茎、茎、叶和须根中分离得到14株内生真菌，包括Paraboeremiasp.、Ilyonectriasp.、Clonostachyssp.、Volutellasp.、Fusariumavenaceum、Cylidrocladiellasp.、Cercosporasp.、Dendryphionnanum、Phomatosporabiseriata、Colletotrichumsp.、Didymellaceaesp.。除去文献中已经报道的Ilyonectria属和Fusarium属[9-12]，其余12株内生真菌未见报道，因此本研究极大地丰富了四川地区黄连内生真菌物种多样性，为后期研究打下良好基础。

黄连作为传统中药，对抗菌抗炎具有良好作用，但在内生菌领域内却鲜有研究，本研究筛选出抑制S.aureus生长的黄连内生真菌菌株Cop L01，属于Colletotrichumsp.。对比国内外文献发现，此类菌是常见的植物内生菌，包括青蒿[21,22]、石斛[23]、红豆杉[24]等植物中均有分离到。同时对于该种菌代谢产物的抑菌活性研究已有不少成果，青蒿内生真菌Colletotrichumsp.代谢产物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌和黑曲霉均有抑菌效果[21]；黄荆内生真菌Colletotrichumsp.甲醇提取物对多重耐药金黄色葡萄球菌表现出抗菌活性，MIC值为31 μg/mL[25]。综上所述，本研究得到的菌株Cop L01值得更深入研究，有必要对Cop L01代谢产物成分的组成、相关化合物的结构等做进一步研究，文献中也报道出具有产小檗碱的黄连内生真菌，可进一步探寻黄连内生真菌是否能够产生与宿主相同或相似的次生代谢产物，亦或是有新型活性物质的出现。内生真菌是天然活性物质来源的一大宝库，研究者应全面深入地开发利用这一资源。