姜乐，王晓兵，贺尔姝，郑晓烨，龚志婷

(大理大学基础医学院人体解剖教研室，云南 大理 671000)

突触可塑性是神经元突触连接长时间改变的能力[1]。DNA甲基化是指DNA的胞嘧啶被甲基化修饰，从而影响其转录，改变下游靶基因表达情况。DNA胞嘧啶甲基化通过协调适应性基因表达和神经元可塑性，在中枢神经系统的早期发育阶段发挥关键作用，并在基因印迹及转录调控，神经发生和神经元可塑性，学习记忆、认知、抑郁症等情况中都有重要作用[2-6]。DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)在有丝分裂后的神经元中大量存在[7]。研究[8-9]表明，DNMTs与突触可塑性、认知应激行为调控有相关性，且前脑缺失DNMT1具有抗焦虑和抗抑郁的作用。

RG108 是一种非核苷类小分子药物，DNMTs抑制剂可以通过直接结合并抑制甲基转移酶的活性位点，而瞬时阻断DNMTs活性，重新激活表观沉默基因[10]。RG108主要与DNMT1结合，也可能与DNMT3a结合[11]。研究表明，RG108可以缓解噪音引起的神经损伤[12]，且DNMT1缺失具有抗抑郁、焦虑作用[9]，提示RG108在神经损伤相关疾病和抑郁/焦虑相关疾病中可能有潜在的治疗价值，所以RG108在神经细胞中的作用值得进一步研究。目前对DNMTs抑制剂药理作用的研究主要集中在抗肿瘤等方面，对其在神经系统疾病的作用机制研究甚少。本实验探究RG108对小鼠海马神经元细胞系HT22生长及突触可塑性相关基因的影响，为进一步开发RG108在神经系统疾病中的应用提供研究基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 HT22 细胞

小鼠海马神经元细胞系 HT22。

1.1.2 药物与试剂

RG108(N-Phthalyl-L-tryptophan)(美国Sigma-Aldrich，商品号R8279，批号 #00000743370)；DMEM高糖培养基(美国Gibco公司，商品号 C1195500BT，批号 8121437)；胎牛血清(FBS，商品号 10270—106，批号 42H9852K)；CCK-8(碧云天，商品号 C0042，批号 031521211214)；胰蛋白酶(中国上海源培生物科技股份有限公司，商品号 S320KJ，批号 G120901)；细胞冻存液(NCM Biotech，商品号 NOc40100，批号20210529)；RNA提取试剂盒(购自生工生物，商品号 B511361—0020，批号 G825KA6755)；cDNA合成试剂盒(购自生工生物，商品号 B532435—0010，批号 H416KA9631)； 两步法RT-qPCR检测试剂盒(promega GoTaq®qPCR Master Mix，商品号 A600A，批号 0000463011)。

1.1.3 主要仪器

酶标仪(美国Bio-Rad公司，型号 19152)；RT-qPCR仪(美国Bio-Rad公司，型号 IMark Microplate Reader)；倒置相差显微镜(日本 Nikon公司)；恒温 CO2培养箱(德国 BINDER 公司，型号 12-12299)；902超低温冰箱(美国Thermo Fisher公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

取冻存的HT22细胞于37 ℃水浴中复苏，加入9 mL含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，37 ℃、5%CO2细胞培养箱内培养，5 h后换液；待细胞长至80%～90%融合时，取对数生长期的细胞，按1︰2传代，进行后续实验。

1.2.2 细胞用药的配制

将10 mg RG108溶于2 mL DMSO中配成5 mg/mL的储存液，并通过0.22 μm滤过膜过滤，使用前用DMEM高糖完全培养基配成0.5、5、50 μmol/L的工作液，用于后续实验。

1.2.3 实验分组及处理

CCK-8实验将HT22海马神经元细胞分为空白对照组、对照组和实验组，将细胞混悬液调整至2×103个/mL的密度接种至三个96孔板中，空白对照组(无细胞)、对照组(细胞，未加药物组)、实验组(细胞，0.5 μmol/L、5 μmol/L、50 μmol/L梯度加药组)。

RT-qPCR实验将HT22海马神经元细胞分为空白对照组、溶剂对照组和实验组，将细胞混悬液调整至1×106个/mL的密度接种至6孔板中，空白对照组(细胞，完全培养基)、溶剂对照组(细胞，DMSO为总体积的0.01%、完全培养基)、实验组(细胞，培养基、50 μmol/L RG108)。药物作用24 h后提取RNA，逆转录成cDNA后行RT-qPCR(根据说明书操作)。

1.2.4 CCK-8 法检测 HT22 细胞增殖(根据说明书操作)

待细胞长到对数生长期，0.25%胰酶消化细胞，2×103个/孔的密度均匀接种于96孔板，置于培养箱中24 h。实验分组与1.2.3中CCK-8分组相同；培养24、48、72 h，相应作用时间结束，弃去各组培养基，每孔加100 μL检测液(90 μL培养基+10 μL CCK-8试剂)，避光放于37 ℃，5% CO2培养箱中，反应2.5 h后，酶标仪检测 450 nm 处的吸光度。细胞增殖率=(实验组吸光度均值-空白组吸光度均值)/(对照组吸光度均值-空白组吸光度均值)×100%。选择最适的作用时间和抑制剂浓度为后续实验的抑制剂作用条件。

1.2.5 RT-qPCR检测基因表达量

培养HT22 海马神经元，传至第3 代细胞接种于6孔板中，培养24 h后加入 RG108 50 μmol/L作用24 h，提取RNA。引物采用oligo 7设计，反应条件按照试剂说明书进行，检测RNA浓度后，使用1 μg RNA 样品逆转录合成cDNA。采用SYBR Green 荧光法进行 RT-qPCR，观察突触可塑性相关性基因的表达情况。

表2 RT-qPCR的反应体系

表3 RT-qPCR实验方案

1.2.6 统计方法

2 结果

2.1 RG108对HT22细胞增殖率的影响

CCK-8结果表明，与对照组比较，经RG108作用48 h后，5 μmol/L组和50 μmol/L组的 HT22 细胞活力显著增加(P<0.05)，且呈浓度梯度依赖性；RG108处理72 h后50 μmol/L组HT22细胞活力增加(P<0.05)，0.5 μmol/L组和5 μmol/L组HT22细胞活力无明显增加，证明50 μmol/L RG108在48 h、72 h均能促进神经元增殖，见图1—2，表4。

图1 RG108处理后细胞形态图(10×)

图2 RG108对HT22细胞增殖的影响

2.2 RG108对HT22细胞突触可塑性相关基因表达的影响

50 μmol/L RG108处理24 h后，使用RT-qPCR方法对突触可塑性相关的几个基因(nr2b、nr2c、nr2d、nr1、bdnf、reln)进行检测，结果发现，nr2c和nr2d有表达量上升的趋势但不显著，而nr1和reln显著降低，差异有统计学意义(P<0.05),见表5，图3。

图3 50 μmol/L RG108处理24 h对基因nr2b、nr2c、nr2d、nr1、bdnf、reln表达的影响

3 讨论

表观遗传学是在不改变DNA序列的情况下，因环境不同而改变基因的表达修饰，从而改变遗传性状[13]。DNA甲基化是一种关键的表观遗传学机制，一般情况下涉及5甲基胞嘧啶的DNA甲基化被称为DNMTs的共价修饰，其可以通过阻止RNA聚合酶和转录因子结合，诱导基因长期表达变化(通常沉默，但偶尔激活，取决于作用的区域)[14]。DNA胞嘧啶被甲基化修饰，使基因组遗传信息更加丰富多彩且具有可塑性。DNA甲基化在体内还是一种负反馈机制，当机体异常时会打破这种平衡，使沉默的DNA及激活的DNA表达异常[2]。研究[15-18]已经证明，DNMTs在记忆形成中的重要性。本研究为进一步了解DNA甲基化在神经系统中的作用、开发DNA甲基化相关的精神疾病治疗方案提供了理论依据。

DNMT1和DNMT3a对于海马神经元的增殖有调控作用[19]，本实验结果亦显示，DNMTs抑制剂RG108对HT22细胞的增殖有促进作用，且呈浓度依赖递增，50 μmol/L RG108在48 h、72 h均对HT22细胞有促进增殖作用。促进神经元的增殖可以在一定程度上保持海马神经元的数目，进而促进中枢神经系统的学习记忆能力[2,7]。

本实验还证明了RG108抑制DNA甲基化后可使突触可塑性相关基因reln、nr1低表达，这一结果和Dong等[20]在精神分裂症模型鼠中得到的结果一致。由于抑制DNMTs通常预期的结果应该是增强基因的表达，但是RG108却对reln、nr1造成了抑制，考虑可能是因为RG108抑制DNA甲基化后中间还有其他靶点调控使reln和nr1基因低表达。由于reln在轴突生长和学习记忆中的重要作用，所以RG108可能对学习记忆造成影响。

一些研究表明，RG108通过转录水平的调节 “改善”了认知，如Dong 等[20]证明了RG108侧脑室给药可以纠正甲基化富集，突触可塑性相关基因与DNMTs结合增加，突触可塑性相关基因表达降低，改善小鼠的精神分裂样行为缺陷。RG108急性给药可以改善抑郁行为，RG108直接靶向DNMTs触发抗抑郁作用，从而抑制应激诱导的DNA甲基化，降低突触可塑性相关基因的甲基化水平，促进了快速抗抑郁作用[6]。RG108急性给药在物体模式分离(object pattern separation，OPS)具有短暂的促进认知作用，靶向促进bdnf1增加[21]。RG108可以改善强迫症行为，可以导致至少1周的明显症状改变和蛋白磷酸酶活性异常变化的完全逆转[14]。本研究表明，RG108可能是通过影响神经元的增殖和突触可塑性相关基因(reln、nr1)达到对小鼠行为的改善作用。

总之，DNMTs抑制剂RG108能促进海马神经元的增殖。并且可以通过抑制DNA甲基化调节神经可塑性相关基因转录，介导突触可塑性相关基因的DNA甲基化水平降低及其转录水平后续增加，故RG108可能在精神疾病治疗中有重要的药物开发价值。