林素仙，王牡丹，王胜男，杨美绿，张智勇，卢阳

类风湿关节炎（RA）的病理特征之一是关节滑膜细胞“肿瘤样”增生；此外，炎性细胞浸润及软骨组织结构破坏也与其密切相关[1-2]。RA滑膜成纤维细胞（RASFs）在RA滑膜增生、关节炎症、软骨关键破坏等方面起着关键作用[3-5]。lncRNA参与炎症、细胞异常增殖和凋亡等病理过程，在RA的发生和发展中起着重要作用[6]。骨关节炎与RA都是常见的风湿性疾病，研究发现lncRNA FOXD2-AS1表达上调与骨关节炎患者的严重程度呈正相关，其可通过海绵化miR-27a-3p在骨关节炎中诱导软骨细胞增殖[7]。抑制FOXD2-AS1可通过靶向miR-206/CCND1轴抑制软骨细胞活力并诱导细胞凋亡[8]。然而lncRNA FOXD2-AS1对RASFs增殖和凋亡影响及机制尚未清楚。miR-331-3p具有抑制炎症反应的作用[9]；但miR-331-3p对RASFs增殖、凋亡影响也尚不清楚。本实验旨在研究lncRNA FOXD2-AS1对RASFs增殖和凋亡的 影响，及其机制是否与miR-331-3p有关，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人正常滑膜成纤维细胞（FLSs）和人类RASFs（RASFs）购自上海冠导生物工程有限公司[C0495、GDC（044349673）]；Trizol试剂购自上海远慕生物科技有限公司；荧光定量试剂盒购自上海易汇生物科技有限公司；RIPA蛋白裂解液购自上海北诺生物科技有限公司；细胞计数试剂盒8（CCK-8）和凋亡检测试剂盒购自北京利维平生物科技有限公司。

1.2 细胞处理与分组 用RPMI-1640培养基常规培养FLSs和RASFs，将lncRNA FOXD2-AS1阴性对照（si-NC）、lncRNA FOXD2-AS1小分子干扰RNA（silncRNA FOXD2-AS1）、miR-331-3p寡核苷酸模拟物（miR-331-3p mimics）及阴性对照mimic NC序列（miR-NC）（广州锐博生物）分别转染至RASFs中，记为si-NC组、si-lncRNA FOXD2-AS1组、miR-331-3p组、miR-NC组，正常培养细胞作为NC组；将si-lncRNA FOXD2-AS1分别与anti-miR-NC、anti-miR-331-3p转染至RASFs中，记为anti-miR-NC+silncRNA FOXD2-AS1 组、antimiR-331-3p+si-lncRNA FOXD2-AS1组。

1.3 RT-qPCR检测lncRNA FOXD2-AS1和miR-331-3p表达 提取FLSs及各组RASFs中总RNA，将RNA反转录成cDNA（42℃反应1 h，95℃5 min），按照试剂盒说明进行PCR，扩增的条件：94℃2 min；94℃30 s，58℃60 s，72℃30 s，共40个循环；72℃延伸5 min；然后进行融解曲线；用2－△△Ct法计算lncRNA FOXD2-AS1相对GAPDH、miR-331-3p相对U6表达量。lncRNA FOXD2-AS1正向引物5’-ACCCA-GGAAATTCCAATTCC-3’，反 向 引 物5’-AAGGGGATCCATTTAATGTGC-3’；miR-331-3p正向引物5’-GGAGAGAAAGGCAGTTCCTG-3’，反 向 引 物5’-GGACCAGAGGAAAGC-CAG-3’；U6正向引物5’-ATTGG -AACGATACAGAGAAGATT-3’，反 向 引 物5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’；GAPDH正向引物5’-AACGGATTTGGTCGTATTG-3’，反向 引 物 5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’。

1.4 蛋白质印迹法检测蛋白表达 提取各组细胞总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，蛋白变性后进行SDS-PAGE，转膜、封闭2 h，分别孵育CyclinD1（1∶800）、Cleaved-caspase-3（1∶800）、-actin（1∶1 000）一抗稀释液（1∶1 000）与二抗稀释液（1∶2 000），反应条件分别为加入一抗稀释液后进行4℃孵育（24 h），加入二抗稀释液后室温孵育1 h，滴加ECL显影，应用ImageJ软件分析各条带灰度值。

1.5 CCK-8检测细胞活性 各组细胞（1×106个/ml）接种于96孔板（100 l/孔），将其置于培养箱内继续培养，分别于转染24、48、72 h时向每孔中加入CCK-8溶液10 l，继续培养2 h后应用酶标仪检测各孔吸光度值（A）。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡 各组细胞加入预冷PBS洗涤后弃上清，将500 l Binding Buffer加入细胞沉淀中重悬细胞，分别将Annexin V-FITC（5 l）与PI（5 l）加入悬浮细胞中，充分混匀后室温避光孵育10 min，应用FACS Calibur流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.7 双荧光素酶报告实验 利用基因突变技术将结合位点进行突变，结合位点与突变位点载入荧光素酶报告基因载体分别构建野生型载体WT-lncRNA FOXD2-AS1、突变型载体MUT-lncRNA FOXD2-AS1，WT-lncRNA FOXD2-AS1、MUT-lncRNA FOXD2-AS1分别与miR-331-3p mimics、miR-NC转染至RASFs中，将转染后的RASFs置于培养箱内继续培养24 h，采用双荧光素酶报告基因检测系统检测各组细胞荧光素酶活性。

1.8 统计学方法 采用SPSS 20.0软件行统计学分析。计量资料用均数标准差表示。多组间各检测指标比较采用单因素方差分析，多重比较用LSD-t检验；两组比较行t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FLSs和RASFs中lncRNA FOXD2-AS1和miR-331-3p表达RASFs中lncRNA FOXD2-AS1表达较FLSs高（1.73±0.12 vs 1.00±0.09，t=14.600，P＜0.05），miR-331-3p表达低（0.47±0.03 vs 1.00±0.10，t=15.229，P＜0.05）。

2.2 lncRNA FOXD2-AS1对RASFs增殖和凋亡的影响si-lncRNA FOXD2-AS1组lncRNA FOXD2-AS1表达量、CyclinD1表达水平、A值较NC组和si-NC组低，细胞凋亡率及Cleaved-caspase-3较NC组和si-NC组高（均P＜0.05），见表1。

表1 lncRNA FOXD2-AS1对RASFs增殖和凋亡的影响（=9）

2.3 miR-331-3p对RASFs增殖和凋亡的影响miR-331-3p组miR-331-3p表达量、细胞凋亡率及Cleaved-caspase-3水平较NC组和miR-NC组高（P＜0.05），CyclinD1表达水平、A值较NC组和miR-NC组低（均P＜0.05），见表2。

表2 miR-331-3p对RASFs增殖和凋亡的影响（=9）

2.4 lncRNAFOXD2-AS1与miR-331-3p靶向关系lncRNA FOXD2-AS1与miR-331-3p有结合位点（表3）。共转染 WT-lncRNA FOXD2-AS1+miR-331-3p mimics的细胞荧光素酶活性较共转染WT-lncRNA FOXD2-AS1+miR-NC的 细 胞 低（0.46±0.03 vs 1.00±0.08，t=18.961，P＜0.05），而共转染 MUT-lncRNA FOXD2-AS1+miR-331-3p mimics的细胞荧光素酶活性与共转染MUT-lncRNA FOXD2-AS1+miR-NC的细胞差异无统计学意义（1.05±0.09 vs 1.00±0.06，t=1.387，P=0.185）。miR-331-3p在si-lncRNA FOXD2-AS1组细胞中表达水平较si-NC组 高（2.04±0.14 1.00±0.02，=22.062，P＜0.05）。

表3 lncRNA FOXD2-AS1和miR-331-3p结合位点预测

2.5 anti-miR-331-3p与si-lncRNA FOXD2-AS1共转染对RASFs增殖和凋亡的影响anti-miR-331-3p+si-lncRNA FOXD2-AS1组细胞中的miR-331-3p表达量、Cleaved-caspase-3水平、细胞凋亡率较anti-miR-NC+si-lncRNA FOXD2-AS1组低，CyclinD1表达水平、A值较anti-miR-NC+si-lncRNA FOXD2-AS1组高（均P＜0.05），见表4。

表4 anti-miR-331-3p与si-lncRNA FOXD2-AS1共转染对RASFs增殖、凋亡的影响（=9）

3 讨论

RA特征之一就是滑膜成纤维细胞的大量增生，滑膜成纤维细胞与肿瘤细胞有相似的增生特征，其异常增殖可侵蚀软骨，最终破坏骨关节[10-11]。因此，抑制RASFs异常激活是有效防治RA的重要途径和方法。研究发现lncRNA参与调控RASFs的增殖和凋亡；如lncRNA PVT1可以通过靶向miR-145-5p调节RA成纤维样滑膜细胞的增殖、凋亡和炎症反应[12]。NEAT1的上调促进了RA成纤维样滑膜细胞增殖，并抑制了细胞凋亡[13]。沉默HOTTIP抑制RASFs增殖，侵袭和迁移，同时增强细胞凋亡[14]。以上研究表明多种lncRNA均参与调控RASFs的增殖和凋亡。为研究lncRNA FOXD2-AS1在RASFs中的作用，本实验首先检测了FLSs和RASFs中lncRNA FOXD2-AS1的表达水平，结果显示，RASFs中lncRNA FOXD2-AS1表达水平高于FLSs。本实验发现抑制lncRNA FOXD2-AS1表达可降低细胞活性，提高细胞凋亡率升高。这表明抑制lncRNA FOXD2-AS1表达可抑制RASFs增殖，促进细胞凋亡。

研究发现miRNA与RASFs的异常增殖相关[15]。本实验发现lncRNA FOXD2-AS1可靶向miR-331-3p；低表达lncRNA FOXD2-AS1后，miR-331-3p表达水平升高，这说明lncRNA FOXD2-AS1可负调控miR-331-3p表达。Zhang等[16]研究显示，miR-331-3p是脊髓损伤大鼠脊髓中表达下调的miRNA，过表达miR-331-3p可通过靶向抑制靶基因RAP1A的表达减轻脊髓损伤大鼠脊髓组织损伤、神经元凋亡和炎症反应，miR-331-3p是脊髓损伤治疗的分子靶点。Ding等[17]研究显示，miR-331-3p在骨关节炎患者膝关节软骨组织、IL-1介导的人关节软骨细胞中表达下调，上调miR-331-3p减轻L-1介导的人关节软骨细胞损伤。本实验还发现RASFs中miR-331-3p表达水平降低；过表达miR-331-3p可降低RASFs细胞活性，提供细胞凋亡率。且抑制miR-331-3p表达可以逆转lncRNA FOXD2-AS1低表达对RASFs增殖和凋亡的影响。