彭利君 刘立宾 王静 方婷婷 蔡龙

在全球范围内，结核病是导致死亡的主要原因之一，预计2020 年结核病是位于COVID-19 之后的第二大单一感染源致死原因[1]。获取优质的检测样本进行灵敏、快速地诊断对结核病的发现和后续治疗至关重要。支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）有助于痰涂片阴性和少痰的结核病诊断。研究表明，BALF 改善了肺结核的检测[2～5]。随着博奥结核/非结核分枝杆菌核酸检测（TB-DNA）、结核分枝杆菌RNA 恒温扩增实时检测技术（simultaneous amplification and

testing for Mycobacterium tuberculosis，SAT-TB）、

Xpert MTB/RIF 检测（Xpert）、涂片、培养等结核病检测技术的广泛开展，这些方法在BALF 样本中的诊断价值尚未得到全面评估。涂片、TB-DNA、SAT-TB 和Xpert 可当日获得检验结果，而培养一般需要2～8 周。在获得BALF 样本后，临床医生为提高检测阳性率，可能对一份样本进行一种或多种检测，本次研究以临床诊断为金标准，通过大样本量数据分析，评估涂片、培养、TB-DNA、SAT-TB、Xpert 检测在BALF 样本中的独立和不同联合方式检测结核的诊断效能，旨在找到一种合适的方案，准确、快速地诊断临床疑似的肺结核。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析2016 年7 月至2021 年9 月期间在浙江大学医学院附属杭州市胸科医院住院治疗的疑似结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染患者的临床资料，所有患者使用同一份BALF 样本且均接受了五项测试（涂片、培养、TB-DNA、SAT-TB 和Xpert），排除了出院时诊断不明确的患者。共收集BALF 标本7 718 份，参照《肺结核诊断和治疗指南》[6]，确诊的肺结核患者4 692 例，确诊为其他疾病的非肺结核患者3 026 例。其中男性4 665 例、女性3 053 例，年龄1～86 岁，平均（46.90±17.80）岁。本次研究经浙江大学医学院附属杭州市胸科医院人体研究伦理委员会批准。由于本次研究为回顾性研究，伦理委员会免除了患者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 标本采集和处理 所有患者均由临床医生采集新鲜BALF 标本10～20 ml，均分后分别进行涂片、培养、TB-DNA、SAT-TB和Xpert检测。

1.2.2 涂片 涂片检查遵守《中国结核病防治规划痰涂片镜检质量保证手册》[7]中的操作程序对BALF标本进行抗酸染色涂片检查。采用抗酸染色试剂（由珠海贝索生物技术有限公司生产）对每份样本行三张抗酸染色涂片镜检。其中一张涂片镜检阳性则为涂片阳性。

1.2.3 培养 按照《结核病实验室标准化操作与网络建设》[8]中的操作程序和标准使用Lowenstein-Jensen 固体培养基（由杭州创新生物技术有限公司生产）和960 液体培养基（由美国BD 公司生产）对BALF 样本进行分枝杆菌培养。固体或液体培养阳性并鉴定为MTB为MTB培养阳性，若鉴定为非结核分枝杆菌（non-tuberculous Mycobacterium，NTM）则视为MTB 培养阴性，固体或液体培养均阴性视为MTB培养阴性。

1.2.4 TB-DNA 检测 提取BALF 样本的DNA，使用SLAN-96S 实时荧光定量检测仪（由上海宏石医疗科技有限公司生产）进行聚合酶链式反应，依据结核/非结核分枝杆菌核酸检测试剂盒聚合酶链式反应荧光探针法（由博奥生物有限公司生产）的说明书，在3 h 内扩增和检测结核特异性IS6110基因和分枝杆菌属共有基因热休克蛋白65（heat shock protein 65，HSP65）。若样本扩增曲线呈S型，且Ct＜40，判定为阳性，否则为阴性。HSP65阳性IS6110 基因阳性为MTB 阳性，HSP65 阳性IS6110 基因阴性为NTM 阳性。HSP65 阴性为MTB 和NTM 均阴性。

1.2.5 SAT-TB 检测 根据制造商提供的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒（由上海仁度生物技术有限公司生产）说明书操作。用实时荧光定量检测仪（SLAN-96S）扩增16S rRNA基因，根据Ct 值判断结果：Ct≤35 为阳性；35＜Ct＜40 需重新检测进行确认；Ct 无数字或＞40 为阴性。

1.2.6 Xpert MTB/RIF 在1～2 ml 未离心BALF 中加入2 倍体积的处理液混合，涡旋振荡15～30 s，在室温放置15 min，取2 ml 处理过的样本溶液缓慢添加到Xpert 实时荧光PCR 检测仪反应盒（由美国Cepheid 公司生产）中，并放置在检测模块中以启动自动检测。系统将在2 h内自动读取MTB 检测结果与利福平耐药结果。实验结果MTB 未检出为阴性，MTB 检出极低、检出低、检出中等和检出高为阳性。

1.3 评价指标 以临床诊断为金标准，计算各项检测方法的灵敏度、特异度、阳性预测值（positive predictive value，PPV）、阴性预测值（negative predictive value，NPV）、曲线下面积（area under the curve，AUC）。

1.4 统计学方法 利用Python 语言和Pandas 包进行数据处理。灵敏度、特异性和PPV、NPV比较采用χ2检验，AUC 的比较采用DeLong 检验。设P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BALF 样本检测结核阳性结果的维恩图见封二图1

图1 BALF检测阳性结果的维恩图

由封二图1 可见，涂片、培养、TB-DNA、SATTB、Xpert 检测在BALF 样本中均为阳性的有680 例。仅有四种方法同时为阳性时，TB-DNA、Xpert、涂片、培养最多为781 例。仅有三种方法同时为阳性时，TB-DNA、SAT-TB、Xpert最多为335 例。仅有两种方法同时为阳性时，TB-DNA 和Xpert 最多为292 例。仅有一种方法检出阳性，最多的是Xpert，可单独检出339 例。

2.2 各检测方法对结核病的诊断价值见表1

表1 涂片、培养、TB-DNA、SAT-TB、Xpert检测肺结核的诊断效能

由表1 可见，五种检测中，Xpert 的灵敏度及NPV 最优，培养的特异度及PPV 最优。对各检测方法的AUC 进行两两比较，TB-DNA 的AUC 与SATTB、Xpert、涂片、培养的AUC 比较，差异均有统计学意义（Z分别=12.80、4.57、48.23、18.84，P均＜0.05）。SAT-TB 的AUC 与Xpert、涂片、培养的AUC 比较，差异均有统计学意义（Z分别=15.63、39.96、8.62，P均＜0.05）。Xpert 的AUC 与涂片、培养的AUC 比较，差异均有统计学意义（Z分别=51.64、23.03，P均＜0.05）。涂片的AUC 与培养的AUC 比较，差异有统计学意义（Z=34.91，P＜0.05）。

2.3 各检测方法对结核病的联合诊断价值 对五种检测方法进行两项、三项、四项、五项排列组合，评估联合后在BALF中对肺结核的诊断效能，见表2～4。

表2 两项联合检测结核的诊断效能

表3 三项联合检测结核的诊断效能

表4 四项和五项联合检测结核的诊断效能

由表2～4 可见，两项、三项、四项、五项最高的AUC 分别为TB-DNA+Xpert 联合、TB-DNA+Xpert+培养联合、TB-DNA+SAT-TB+Xpert+培养联合、五项联合。对以上最优的组合方式进行诊断效能比较发现：两项联合的灵敏度低于三项、四项、五项联合（χ2分别=4.05、10.38、13.33，P均＜0.05），三项、四项、五项联合之间的灵敏度进行两两比较，差异无统计学意义（χ2分别=1.47、2.69、0.18，P均＞0.05）；两项联合特异度与三项和四项相比，差异无统计学意义（χ2分别=0.00、0.72，P均＞0.05），三项联合的特异度与四项相比，差异无统计学意义（χ2=0.72，P＞0.05），五项联合的特异度低于两项、三项、四项（χ2分别=31.10、31.10、22.69，P均＜0.05）；两项联合的PPV 与三项和四项相比，差异无统计学意义（χ2分别=0.03、0.28，P均＞0.05），三项联合的PPV与四项相比，差异无统计学意义（χ2=0.52，P＞0.05），五项联合的PPV 低于两项、三项、四项（χ2分别=24.69、26.93、20.49，P均＜0.05）；两项联合的NPV 低于四项联合（χ2=4.38，P＜0.05），两项与三项、两项与五项、三项与四项、三项与五项、四项与五项之间的NPV 之间，差异均无统计学意义（χ2分别=1.82、3.28、0.56、0.22、0.07；P均＞0.05）。两项联合的AUC 低于三项和四项（Z分别=9.63、9.90，P均＜0.05），三项联合的AUC 低于四项和五项（Z分别=4.14、3.65，P均＜0.05），五项联合的AUC 低于四项（Z=6.97，P＜0.05），两项联合与五项的AUC 之间比较，差异无统计学意义（Z=1.62，P＞0.05）。

3 讨论

痰涂片镜检经济、易于操作，但其灵敏度较低，且不能区分MTB 和NTM 感染。分枝杆菌培养敏感度较高，一直作为结核病的金标准，但其检测周期长，不利于肺结核的快速诊断。TB-DNA 可在数小时内同时检测MTB 或NTM 感染，防止临床对肺NTM 和肺结核的误诊。SAT-TB 是以MTB 特异的16S rRNA 为靶标，可快速准确地检测存活的结核分枝杆菌。Xpert检测可以在2 h内同时检测出结核病和利福平耐药情况，优势是操作简单，结果可靠，为患者提供及时、有效的治疗指导，并协助限制耐多药结核病的传播，缺点是成本较高。

本次研究通过比较涂片、培养、TB-DNA、SATTB、Xpert 在BALF 样本中的检测效能发现，在单独诊断BALF 样本结核时Xpert 明显优于其他检测，三种分子诊断方法的诊断效果均高于传统的培养和涂片。但是考虑到各种方法的优缺点和临床有多种方法同时用于检测结核以增加阳性检出率的需求，对五种检测进行排列组合后比较诊断效能发现：两项联合中TB-DNA+Xpert 联合最佳、三项联合中TB-DNA+Xpert+培养联合最佳、四项联合中TB-DNA+SAT-TB+Xpert+培养联合最佳。理论上联合检测的项目越多，灵敏度越高。但综合考虑经济、周转时间、指导后续治疗等因素，推荐两项中的TB-DNA+Xpert 联合或四项联合中TBDNA+SAT-TB+Xpert+培养联合来提高结核的阳性检出率。因为TB-DNA+Xpert 联合与五项联合的AUC 之间差异无统计学意义。TB-DNA+Xpert联合可以获得的收益包括：两种检测的灵敏度可达66.94%，略低于五项联合的70.44%；当日可出报告，速度快；可以同时鉴别MTB 和NTM 感染；可以获得利福平耐药情况。TB-DNA+SAT-TB+Xpert+培养联合的灵敏度（70.03%）与五项（70.44%）最佳联合相比，差异无统计学意义。TB-DNA+SATTB+Xpert+培养联合与TB-DNA+Xpert 联合相比增加了培养和结核RNA 检测，可以判定体内存在活菌且后续获得纯菌株可进行更多药敏检测，弥补Xpert 只包括利福平药敏的局限性。

值得注意的是，即使使用五项联合依然有29.37%的漏诊，这可能是由于某些患者根本不排菌，通过实验室方法无法提供病原学依据，这个时候医生可以选择免疫学和病理学的检验来提高检测阳性率并参考患者的影像学表现和抗结核治疗反应来确诊。在BALF 样本中诊断结核时，Xpert 明显优于涂片、培养、TB-DNA、SAT-TB；临床为提高结核阳性检出率进行项目联合时，推荐使用TBDNA+XPERT 联合或TB-DNA+SAT-TB+Xpert+培养联合的方案检测结核。