张翠忠，张贞发，向 刚，黄 青，连 欢，刘凤平，黄 唯，周树年，李许明，李福燕

（广西民族师范学院化学与生物工程学院，光电化学传感与区域环境分析实验室，广西 崇左 532200）

过氧化氢（HO）作为去色剂等常添加在各种快消食品中，当浓度超出0.7 μmol/L，可能导致蛋白质和DNA的严重损伤，进而诱发慢性肾功能衰竭、急性肾损伤等疾病。因此，开发新方法检测食品中HO含量对食品安全具有重大意义。目前，用于HO检测的方法包括荧光法、化学发光法、滴定法、比色法、表面增强拉曼光谱和电化学法等。其中，电化学传感器技术因其灵敏度高、成本低、响应速度快等特点已被广泛关注。然而，传感器的灵敏度、选择性和稳定性等性能与电极表面修饰材料息息相关。

银纳米粒子（AgNPs）造价成本相对较低、毒性低，对HO具有好的催化特质。然而，贵金属粒子受表面电荷影响易团聚，大量结果显示粒子粒径降低到纳米尺度，催化剂才能发挥其催化能力。通常采用支撑材料(碳材料、金属氧化物、金属有机框架材料等)负载贵金属克服纳米粒子团聚现象。

石墨烯气凝胶（graphene aerogels，GAs）具有多孔结构。制备过程中，氧化石墨烯（graphene oxide，GO）的部分含氧官能团被还原，冷冻干燥时，GO之间的氢键被削弱，致使机械强度弱化。Zhong Jing和Wan Wenchao等为了提高GAs结构强度，引入机械强度良好的多壁碳纳米管（multi walled carbon nanotube，MWCNT），该MWCNT-GA复合材料可使GAs在外力诱导的变形下保持结构完整性。最近，Ryu等在此基础上引入多巴胺（dopamine，DA）作为交联剂加固二者化学键合。DA在弱碱环境中可以自发地氧化、自聚合在材料表面，形成富含儿茶酚和氨基官能团的聚多巴胺（polydopamine，PDA）层。PDA通过自身携带的氨基和羟基将羧基化的MWCNT和GO缩合形成混合气凝胶（mixed aerogels，MAs），MAs形貌类似“卷心菜状”，其微观结构表现为3维（3-dimensional，3D）分层多孔结构，该结构具有良好的机械强度，不易坍塌，稳定性好，尤其能提供优异的传质通道，已逐步应用于传感和吸附等平台。然而，鲜见AgNPs改性的MAs（MAs-AgNPs）复合材料应用于HO电化学检测的相关报道。

本研究采用回流法化学还原硝酸银（AgNO）制备AgNPs并负载于MAs，以3D AgNPs-MAs复合材料修饰玻碳电极（glassy carbon electrode，GCE）制备用于食品中HO测定的电化学传感器。以对HO的电流响应为指标，对AgNPs-MAs-GCE修饰电极的条件进行优化；并与制备的其余修饰电极（如AgNPs-GCE和MAs-GCE）进行电化学测试及对比分析；使用牛奶样品对AgNPs-MAs-GCE修饰电极进行实际样品测试及回收率分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛奶 广西石埠乳业有限公司；透析袋（截留分子质量3 500 Da） 湖南电禾公司；石墨粉、羧基化MWCNT 南京先丰纳米材料科技有限公司；盐酸DA上海恒斐生物科技有限公司；AgNO、HO国药集团化学试剂有限公司；以上试剂均为分析纯；实验用水均为去离子水。

1.2 仪器与设备

CHI760E电化学分析仪 上海辰华仪器有限公司；GCE（直径3 mm）、铂柱电极、饱和甘汞电极 天津英科联合科技有限公司；80-ZB离心机 上海雅荣生化仪器设备有限公司；CTFD-10冷冻干燥机 上海拓纷机械设备有限公司；SU5000场发射扫描电镜 日立高新技术公司。

1.3 方法

1.3.1 MWCNT-PDA的制备

参考Ryu等提出的方法。将0.10 g羧基化MWCNT溶于200 mL去离子水，超声处理30 min使其分散均匀，在搅拌情况下缓慢地加入0.20 g DA。用三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液将该混合物的pH值调整为8.5，并在室温下连续搅拌该悬浮液48 h。5 000 r/min离心5 min，去除上清液，用去离子水和乙醇溶液多次冲洗并进行透析，以完全去除游离的DA。冷冻干燥24 h，最终获得MWCNT-PDA。

1.3.2 MAs的制备

参考Hummers和Zhan Wenwei等的方法。将GO透析数天，直至溶液pH值趋于中性，冷冻干燥，得到透析后的GO。将MWCNT-PDA∶GO以质量比1∶4溶于一定体积的去离子水，超声溶解，其中GO质量浓度为2.00 mg/mL。将25 mL混合溶液转入反应釜，90 ℃反应12 h。将反应产物倒入透析袋，以去离子水和乙醇溶液交替透析数天，液氮冷冻后进行干燥，再在750 ℃以氮气保护退火3 h，得到MAs。

1.3.3 AgNPs-MAs的制备

参考并改进Shi Lei等的合成技术。将0.040 g AgNO置于小烧杯中，加入20 mL乙二醇，超声处理0.5 h。加入0.02 g MAs静置2 h后，在圆底烧瓶中加入0.2 mL水合肼和0.5 mL 0.4 mol/L NaOH溶液，保持150 ℃，在油浴锅中回流4 h。用二次水和乙醇依次清洗、6 000 r/min离心5 min，真空干燥后得到AgNPs-MAs。重复上述步骤制备AgNPs（不加MAs）。

1.3.4 AgNPs-MAs-GCE及其他修饰电极的制备

将AgNPs-MAs分散于,-二甲基甲酰胺，使溶液中AgNPs-MAs质量浓度为1 mg/mL，用移液枪取5 μL复合物溶液滴涂于事先打磨好的GCE表面，自然晾干，得到AgNPs-MAs-GCE修饰电极。此外，其他对比性修饰电极（如AgNPs-GCE和MAs-GCE）的制作程序与此相似。

1.3.5 扫描电镜和能谱测试

扫描电镜：扫描探头为二次电子探头，扫描电压10 kV，工作距离8.5 mm，探针电流20 pA。

能谱扫描实验参数：扫描电压10 kV，工作距离6.9 mm。

1.3.6 修饰电极的电化学测试

采用电化学阻抗法在5 mmol/L [Fe(CN)]/[Fe(CN)]+0.1 mol/L KCl溶液中测试不同修饰电极的电化学阻抗表征，偏压0.2 V，频率范围10 000～0.5 Hz，交流振幅5 mV。

采用循环伏安法测试不同修饰电极对HO的电流响应，电压范围-0.5～0.6 V，扫描速率为50 mV/s，HO浓度为10 mmol/L。

采用计时库仑法在0.1 mmol/L [Fe(CN)]/[Fe(CN)]+0.1 mol/L KCl溶液中测试电量评估AgNPs-MAs-GCE修饰电极的有效面积，电压范围0.25～0.5 V，脉冲宽度0.25 s，圈数为1 圈。

采用计时电流法制作标准曲线，以AgNPs-MAs-GCE为工作电极，最佳测试条件下，保持基线平稳后，向10 mL磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中每隔50 s等量添加20 μL 5 mmol/L HO溶液。

采用计时电流法考察电极稳定性，将AgNPs-MAs-GCE修饰电极保存于4 ℃冰箱，每隔10 d在相同条件下测试对HO的电流响应，其中，偏压-0.4 V，缓冲液为磷酸盐缓冲液（pH 7.4），电极修饰液体积5 μL；而AgNPs-MAs-GCE修饰电极的重复性测定，需要修饰3 根相同的电极，测定条件与稳定性保持一致。

采用计时电流法考察AgNPs-MAs-GCE修饰电极的抗干扰性，测试时分3 个环节。首先，滴加HO，其次，滴加干扰物，最后，继续滴加HO，而测试条件与稳定性保持一致。

1.3.7 AgNPs-MAs-GCE修饰电极的实际样品测试及回收率分析

采用计时电流法测试实际样品和回收率，测试前将牛奶于6 000 r/min离心5 min，移取上清液1 mL，将其溶于10 mL磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中，采用标准加入法进行回收实验。

1.4 数据处理

每个实验均重复3 次。使用Zview 3.10软件对电化学阻抗奈奎斯特图的数据进行拟合，其他数据使用Origin 8.5软件进行分析和绘制。

2 结果与分析

2.1 AgNPs-MAs-GCE修饰电极及其材料的扫描电镜表征

从图1A～E可以看出，GO褶皱明显并呈现规则的较大孔洞，这为后续3D MAs的制备提供支撑；MWCNTPDA呈螺旋弯曲，直径小于50 nm且长度约为1 μm；3D MAs的横切面呈分层多孔结构，类似“卷心菜状”；AgNPs直径为30～50 nm，大小基本均匀，相对分散；AgNPs-MAs复合材料修饰GCE表面特征，发现大量AgNPs负载于MAs中。肉眼观察MAs呈现圆柱状，冷冻干燥后，表面粗糙，层状分布明显并有大孔（图1F）。

图1 GO（A）、MWCNT-PDA（B）、MAs（C）、AgNPs（D）、AgNPs-MAs-GCE（E）扫描电镜图和MAs实物图（F）Fig. 1 Scanning electron microscopic images of GO (A),MWCNT-PDA (B), MAs (C), AgNPs (D), AgNPs-MAs-GCE (E) and pictures of MAs (F)

2.2 AgNPs-MAs复合材料元素图谱表征分析

由图2可知，AgNPs-MAs复合材料的主要元素为Ag（紫色）、O（蓝色）和C（绿色），相对含量分别为55.64%、2.37%和41.99%。

图2 AgNPs-MAs的扫描电镜图（A）、面扫元素图（B）和能量色散X射线谱图（C）Fig. 2 Scanning electron microscopic image (A), scanning electron microscopic elemental mapping image (B), and energy-dispersive X-ray spectroscopic image (C) of the AgNPs-MAs

2.3 不同修饰电极的电化学阻抗表征

将制备的GCE、AgNPs-GCE、MAs-GCE和AgNPs-MAs-GCE电极分别置于三电极体系中进行电化学阻抗测量，结果如图3所示。半圆的直径长度表示高频电子传递的限制过程，而直线部分表示低频溶液扩散限制过程。采用Zview软件，进行等效电路拟合（图4），GCE、AgNPs-GCE、MAs-GCE和AgNPs-MAs-GCE电极的电荷转移电阻（）分别为955.5、3 342、326.7 Ω和384.8 Ω，说明AgNPs分散于3D MAs多层结构中时，其降为最小值，这更利于电荷转移。

图3 不同修饰电极的电化学阻抗图谱Fig. 3 Nyquist plots of different modified electrodes

图4 不同修饰电极的等效电路图Fig. 4 Equivalent circuits for different modified electrodes

2.4 不同修饰电极对H2O2的电流响应分析

如图5所示，GCE和MAs-GCE在HO溶液中没有明显的氧化还原峰，二者电流区别不大；AgNPs-GCE对HO具有催化作用，显示较强的氧化还原峰；AgNPs-MAs-GCE对HO响应明显增大，其还原峰电流分别是AgNPs-GCE的1.8 倍和GCE的24.5 倍。这归因于MAs材料的分层多孔结构方便快速传质以及分散于该结构中的AgNPs催化协同作用，AgNPs在MAs加持下，大幅度提高催化活性位点的密度性，活性位点与HO在3D空间中充分接触。

图5 不同修饰电极的循环伏安图Fig. 5 Cyclic voltammograms of different modified electrodes

2.5 AgNPs-MAs-GCE修饰电极测试条件优化分析

2.5.1 扫描速率对AgNPs-MAs-GCE修饰电极HO电化学行为的影响

由图6A可知，在30～110 mV/s扫描速率范围内，氧化和还原峰电流随扫描速率的增大而增大，且峰电流与扫描速率的平方根呈正比关系（图6B），即HO在AgNPs-MAs-GCE电极周围的电子转移受扩散控制。

图6 AgNPs-MAs-GCE修饰电极在不同扫描速率下对H2O2电流响应（A）及H2O2峰电流响应与扫描速率平方根的线性关系图（B）Fig. 6 Current response at different scanning speeds of the electrode AgNPs-MAs-GCE (A) and linear relationship between peak current and square root of scanning speed (B)

2.5.2 pH值对AgNPs-MAs-GCE修饰电极HO电化学行为的影响

如图7所示，随着pH值从5.5增至7.4，峰电流依次增加，随后进入碱性环境，随着pH值增大峰电流降低。因此，本实验得到的最优pH 7.4。

图7 AgNPs-MAs-GCE修饰电极的pH值与峰电流的关系Fig. 7 Relationship between peak current and pH for AgNPs-MAs-GCE

2.5.3 偏压对AgNPs-MAs-GCE修饰电极HO电化学行为的影响

如图8所示，随着偏压增加，电流响应信号增加，噪音信号也同步增加；偏压为-0.7 V时，噪音信号明显扰乱电流信噪。此外，偏电压太大，传感器的选择性会受到挑战。为了保证传感器的灵敏性和选择性，本实验选择-0.4 V为工作偏压。

图8 AgNPs-MAs-GCE修饰电极在不同偏压下对H2O2的电流响应Fig. 8 Current response to H2O2 at different bias levels of AgNPs-MAs-GCE

2.5.4 修饰液体积对AgNPs-MAs-GCE修饰电极HO电化学行为的影响

如图9所示，5 μL AgNPs-MAs修饰液会使AgNPs-MAs-GCE电极产生较高的响应信号，其他体积修饰液下的电流响应波动不大，所以本实验以5 μL为最优AgNPs-MAs修饰液体积。

图9 AgNPs-MAs-GCE修饰电极在不同修饰液体积下H2O2电流响应Fig. 9 Current response to H2O2 at different volumes of modified electrode solution of AgNPs-MAs-GCE

2.6 AgNPs-MAs-GCE修饰电极的有效面积分析

采用计时库仑法测试修饰电极AgNPs-MAs-GCE在0.1 mmol/L [Fe (CN)]溶液中电量和时间的关系，计算修饰电极的有效面积。参考公式如下：

式中：为电荷量；为电极有效面积；为溶液中的初始摩尔浓度；为电子的转移数量；为法拉第常数（96 480 C/mol）；为电解时间；为扩散系数（7.610 6 cm/s）；为双层电荷；为Faradaic电荷。

如图10所示，AgNPs-MAs-GCE和GCE电极的拟合曲线方程分别是＝19.2+0.69（＝0.992 6）和＝6.86+0.13（＝0.998 3），根据其斜率，得到AgNPs-MAs-GCE修饰电极的有效面积是裸GCE的2.8倍，说明修饰材料有可能在实验中起到富集作用增大电流响应。

图10 AgNPs-MAs-GCE修饰电极的电量与时间关系曲线（A）、电量与时间平方根的线性关系图（B）Fig. 10 Charge versus time curve for AgNPs-MAs-GCE (A), and linear relationship between charge and square root of time (B)

2.7 AgNPs-MAs-GCE修饰电极对H2O2标准曲线的建立

如图11所示，随着电解池中HO浓度的增加，峰电流有规律地攀升且峰电流与HO浓度成呈良好线性关系，其线性方程为＝0.32+1.66（＝0.999 3），线性范围为9.98～136 μmol/L，检出限0.02 μmol/L（信噪比为3）。该传感器的灵敏性高于目前文献报道值，如表1所示。高灵敏性可能归功于：以3D分层多孔结构的复合材料修饰电极能明显增大被测物接触空间，改善了目标离子的传质效率；分散的AgNPs提供了足够的识别位点并增强了响应信号的接收。

图11 连续滴加H2O2的计时电流响应曲线（A）及电流与H2O2浓度的线性关系（B）Fig. 11 Amperometric response curves of AgNPs-MAs-GCE with successive addition of H2O2 (A), and linear relationship between peak current and concentration of H2O2 (B)

表1 基于类似纳米材料的电化学传感器H2O2检测性能比较Table 1 Comparison of the analytical performance of electrochemical sensors based on similar nanomaterials for H2O2 detection

2.8 AgNPs-MAs-GCE修饰电极的稳定性和重复性分析

如图12所示，第30天该修饰电极的响应电流比第1天降低18.4%，电极活性保持在81.5%以上，而3 根AgNPs-MAs-GCE电极的相对标准偏差分别为1.52%、3.2%和3.1%。以上数据显示该修饰电极构建的HO电化学传感器具有较好的稳定性和重复性。

图12 AgNPs-MAs-GCE电极的稳定性和重复性Fig. 12 Stability and repeatability of AgNPs-MAs-GCE

2.9 AgNPs-MAs-GCE电极的抗干扰性分析

如图13所示，向磷酸盐缓冲液等时间、等体积地添加20 μL 5 mmol/L HO后，发现电流响应随添加次数依次增加；依次添加等浓度的干扰物盐酸DA、酪氨酸（tyrosine，Tyr）、尿酸（uric acid，UA）、色氨酸（tryptophan，Try）、柠檬酸（citric acid，CA）和抗坏血酸（ascorbic acid，AA）于电解池，发现只有UA对应的电流有轻微浮动，其余干扰物对应的电流几乎没有增加；最后继续添加HO，发现电流响应并未受电解池测试环境的影响，依然随HO添加次数而增加。因此，该修饰电极构建的HO电化学传感器具有良好的抗干扰能力。

图13 AgNPs-MAs-GCE电极的抗干扰能力Fig. 13 Anti-interference capacity of AgNPs-MAs-GCE

2.10 AgNPs-MAs-GCE修饰电极测量的回收率分析

如表2所示，牛奶样品的回收率在98.1%～98.8%之间，相对标准偏差为0.58%～2.28%。说明该方法建立的传感器回收率高，实验数据准确度高，有望用于检测实际样品。

表2 AgNPs-MAs-GCE修饰电极测定牛奶样品回收率Table 2 Recoveries of H2O2 spiked in milk samples using AgNPs-MAs-GCE

3 结 论

以3D MAs负载AgNPs制备高稳定性和传质效率优异的分层多孔复合材料修饰GCE构建AgNPs-MAs-GCE电化学传感器并采用计时电流法检测HO。随着HO浓度的增加，峰电流与浓度呈良好线性关系，其线性方程为＝0.32+1.66（＝0.999 3），线性范围9.98～136 μmol/L，检出限0.02 μmol/L（信噪比为3）。该传感器保存至第30天时，该修饰电极的活性保持在81.5%以上，重复性的相对标准偏差低于3.2%，对于实际样品的回收率保持在98.1%～98.8%之间，实验结果表明，该传感器有望用于食品中HO的高灵敏性检测。此外，该传感器也存在一些不足，不能同时检测多种组分，若将计时电流法与原位拉曼技术或微流控技术结合，有望同时检测多种组分。