孙亚宁，杨苏珍，杨继飞，胡骁飞，陈鑫鑫，张颖硕，邓瑞广，张改平,2,*

（1.河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002；2.河南农业大学动物医学院，河南 郑州 450002）

呕吐毒素（deoxynivalenol，DON），又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇，主要由曲霉、青霉及镰刀菌产生的单端孢霉烯族真菌毒素，在谷物、谷物制备及动物饲料中广泛存在。DON具有胃肠毒性、细胞毒性、免疫毒性等，且与其他真菌毒素具有协同毒性，严重危害动物和人类身体健康。GB 2761—2017《食品中真菌毒素限量》中对谷物及其制品中DON的允许限量为不高于1 000 μg/kg。控制DON危害的最有效手段是能快速、准确地检测DON污染。DON常用的检测方法有薄层色谱法、高效液相色谱法、表面增强拉曼光谱法、电化学法传感器法及免疫学检测方法等。

免疫层析法由于具有快速、灵敏、特异、稳定、成本低，特别是操作简单等特点，已经普遍应用于真菌毒素的快速检测。Kong Dezhao等建立了DON胶体金免疫层析试纸，在谷物及饲料中的检出限为50～750 μg/kg。由于传统的胶体金免疫层析试纸灵敏度已经不能满足检测的需要，越来越多的新型标记材料（特别是荧光纳米材料）逐渐应用于免疫层析试纸中提高检测灵敏度。Huang Xinyu等研制了一种基于花状金纳米颗粒的免疫层析试纸条，同时检测中药中伏马菌素B（fumonisin B，FB）和DON，检测灵敏度为50 μg/kg。Jin Yongpeng等建立了基于近红外荧光染料800CW和680LT的免疫层析试纸，同时检测玉米中的玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）和DON，检出限分别为0.55 μg/kg和3.8 μg/kg。Goryacheva等建立了一种基于硅烷化量子点免疫层析试纸，同时检测谷物中的ZEN和DON，检出限分别为40 μg/kg和400 μg/kg。Dong Haowei等建立了基于聚苯乙烯荧光微球标记的免疫层析试纸，检测范围为1～100 ng/mL，在玉米和饲料中的检出限分别为0.206 ng/mL和0.216 ng/mL。提高检测灵敏度的另一个方向是利用磁性纳米材料实现样品中靶标物的富集。Han Qiqi等基于金属-有机框架的多靶点免疫磁珠实现了食品中DON、ZEN、T-2毒素的富集。Zhuo Siqi等利用磁性光子晶体微球实现样品中DON的富集，但是磁颗粒对样品富集后通常需要复杂的洗脱过程才能用于检测。

磁荧光纳米复合材料即具有磁性可以富集待测物又同时具有荧光特性实现信号放大，已广泛应用于生物传感、药物输送、临床呈像等领域，而在免疫检测领域还处于起步阶段。目前鲜见磁荧光免疫层析试纸在真菌毒素检测方面的报道。由于磁性纳米颗粒与荧光微球结合后会造成荧光微球的猝灭，目前磁荧光纳米颗粒需要复杂的制备过程，不利于广泛应用。

本研究利用磁性纳米颗粒和绿色荧光蛋白及DON单克隆抗体一步法制备磁性荧光抗体探针，建立DON磁荧光免疫层析试纸，并将其应用于谷物中DON污染物的检测中；同时建立DON胶体金免疫层析试纸，对比两种方法的灵敏度，判定新模式的有效性。本研究采用一步法制备磁性荧光抗体探针应用于的免疫层析检测技术中，同步实现样品的富集及荧光信号的检测，从而提高检测灵敏度，促进磁荧光纳米颗粒在免疫检测领域的广泛应用，为更灵敏的免疫层析检测方法提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

DON 青岛普瑞邦生物工程有限公司；柠檬酸三钠、绿色荧光蛋白 北京索莱宝科技有限公司；牛血清白蛋白（bull serum albumin，BSA） 英国BDH公司；黄曲霉毒素B（aflatoxin B，AFB）、ZEN、赭曲霉毒素（ochratoxin A，OTA）、FB、T-2、三氯化铁、葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein A，SPA）、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐（1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC）美国Sigma公司；Tween-20 德国Merck公司；硝酸纤维素膜（NC膜，HF13502S25，（30×2.5）cm）、玻璃纤维棉、吸水纸、支撑底板 德国Millipore公司；DON单克隆抗体由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室自制；实验用超纯水由实验室自制；氢氧化钠等其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

AE260电子天平 德国Mettler公司；JEM-1400透射电子显微镜 日本电子株式会社；4-16K离心机德国Sigma公司；ESE-Quant FLUO荧光读条仪 德国QIAGEN公司；RH Digital KT/C磁力搅拌器 德国IKA公司；Zetasizer Nano ZS90型动态散射粒度分析仪 英国Malvern公司；SpectraMax i3x多功能酶标仪 美国Molecular Devices公司；XYZ-3000型喷膜喷金仪、CM-4000型斩切机、TSR3000读条仪 美国Bio-Dot公司；电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；ZHS-SP低露点转轮除湿机 无锡奥波公司。

1.3 方法

1.3.1 羧基修饰的超顺磁纳米颗粒的制备及表征

采用溶剂热法制备粒径为100～300 nm的超顺磁颗粒。称取3 组三氯化铁（0.675、0.675、0.844 g）及柠檬酸钠（0.324、0.245、0.245 g），分别加入20 mL乙二醇中，于加热磁力搅拌器上，90 ℃加热搅拌至溶解，再分别加入1.2 g醋酸钠，继续加热搅拌至完全溶解，然后将得到棕色溶液转移至100 mL聚四氟乙烯内衬的反应釜中，200 ℃烘箱加热10 h，自然冷却后产物呈黑褐色，用无水乙醇、乙醇-超纯水（1∶1，/）、超纯水清洗3 次，超纯水定容至20 mL，分装2 mL/瓶，冷冻干燥密封，4 ℃保存备用。

选用Zetasizer Nano ZS90型动态散射粒度分析仪分析及透射电子显微镜进行表征。利用强力磁铁鉴定超顺磁颗粒的磁性：取1 mL磁颗粒于玻璃瓶中，放于强力磁铁上观察磁颗粒吸附情况。

1.3.2 一步法制备DON磁荧光抗体探针

选用活泼酯法将羧基磁颗粒与绿色荧光蛋白及DON单抗进行一步法偶联制备磁荧光抗体探针。取2号磁颗粒200 μL加入20 μL EDC（1 mg/mL）及40 μL NHS（1 mg/mL）室温避光搅拌反应3 h为A液。取CBS 200 μL加入绿色荧光蛋白2.5 μg、DON单抗2.5 μg，室温避光搅拌反应1 h，在强力磁铁吸附下分离磁颗粒，去上清液，200 μL重悬液（0.02 mol/L的NaBO·10HO溶液含1% BSA、3%海藻糖、0.05%叠氮钠）重悬得到磁荧光抗体探针。偶联过程中优化了绿色荧光蛋白及DON单克隆抗体的加入量，绿色荧光蛋白与DON单克隆抗体按1∶1加入，200 μL磁颗粒中蛋白加入量分别为5 μg（2.5 μg+2.5 μg）、2.5 μg（1.25 μg+1.25 μg）、1.25 μg（0.625 μg+0.625 μg）、0.625 μg（0.313 μg+0.313 μg），偶联结束后用强力磁铁吸附磁颗粒，多功能酶标仪分别检测偶联后上清液与偶联前的蛋白溶液中荧光信号（激发波长430 nm、发射波长510 nm），确定较优蛋白加入量。用强力磁铁检测磁荧光抗体探针的磁性；将磁荧光抗体探针加于重悬液中用NC膜上包被有SPA的试纸进行检测，目察SPA拦截探针情况，从而判断磁珠与抗体偶联是否成功；然后通过荧光读条仪扫描试纸荧光信号，鉴定探针荧光性能。

1.3.3 DON胶体金标记抗体探针制备

为验证磁荧光免疫层析试纸的有效性，利用相同的免疫学试剂建立胶体金免疫层析试纸。

1.3.3.1 胶体金制备

以柠檬酸三钠为还原剂制备胶体金。取100 mL 超纯水加入三角瓶中，于加热磁力搅拌器上加热，加入1 mL 1%氯金酸溶液加热至沸腾，然后搅拌状态下迅速加入1.6 mL 1%柠檬酸三钠溶液，溶液颜色经过透明-黑色-深红色-酒红色变化，待颜色不再变化时再加热5 min，室温冷却后，用超纯水将胶体金定容至100 mL，4 ℃保存备用。

1.3.3.2 胶体金标记单克隆抗体

取DON单克隆抗体用超纯水稀释为2 mg/mL备用。取稀释杯6 孔，分别加入10 μL超纯水铺底，于第一孔中加入稀释好的单克隆抗体10 μL，倍比稀释至最后一孔。取胶体金用0.2 mol/L的KCO溶液调节pH值为8.2，然后加入上述稀释杯中，125 μL/孔，反应5 min，加入125 μL/孔10% NaCl，观察胶体金颜色变化，选择能保持胶体金颜色不变的最低抗体浓度为抗体标记浓度。

取10 mL胶体金0.2 mol/L的KCO溶液调节pH值为8.2。将DON单克隆抗体，用超纯水稀释为1 mg/mL，取60 μL缓慢加入到调好pH值的胶体金中，边加边搅拌，然后室温反应70 min，然后再加入1 mL 10% BSA溶液，室温封闭10 min，4 ℃、12 000 r/min离心30 min，弃上清液，沉淀用4 mL重悬液重悬，4 ℃保存备用。

1.3.4 DON免疫层析试纸的组装

1.3.4.1 免疫层析试纸各组分的制备

取NC膜分别在检测线（T线）及质控线（C线）位置，用XYZ-3000型喷膜喷金仪按0.9 μL/cm的量喷涂0.2 mg/mL DON-BSA及0.2 mg/mL的SPA，42 ℃干燥1 h，避光密封备用。

结合垫制备：将0.02 mol/L的NaBO·10HO溶液（含5% BSA、0.1% PVP-10、0.1% Triton X-100、0.05%叠氮钠），用XYZ-3000型喷膜喷金仪按8 μL/cm的量喷涂在玻璃纤维棉（8 mm×30 mm）上，42 ℃干燥50 min制备结合垫。将胶体金标记DON单克隆抗体用XYZ-3000型喷膜喷金仪按6.5 μL/cm的量喷涂在结合垫上，42 ℃干燥50 min制备胶金垫，避光密封备用。

样品垫制备：将玻璃纤维棉（16 mm×30 mm）浸泡于0.1 mol/L的PB溶液（pH 7.4，含1% BSA、0.3%Tween 20、5%海藻糖、0.05%叠氮钠）中5 min后取出平铺于干燥箱内，42 ℃干燥4 h制备样品垫。

1.3.4.2 试纸组装

DON胶体金免疫层析试纸组装：取制备好的NC膜、胶金垫、样品垫及吸水纸依次粘贴于支撑底板上，各组分间重叠1～2 mm，用切割机切成3.0 mm的试纸加干燥剂密封保存。

DON磁荧光免疫层析试纸组装：取制备好的NC膜、结合垫、样品垫及吸水纸依次粘贴于支撑底板上，各组分间重叠1～2 mm，用切割机切成3.0 mm的试纸加干燥剂密封保存，搭配DON磁荧光抗体探针使用。

1.3.5 试纸的检测方法

DON胶体金免疫层析试纸的检测方法：取100 μL样品于反应杯中，插入胶体金免疫层析试纸检测，10 min后观察结果。

DON磁荧光免疫层析试纸的检测方法：取300 μL样品于反应杯中，然后加入1 μL磁荧光抗体探针，孵育10 min后，用强力磁铁分离，100 μL重悬液重悬后插入磁荧光免疫层析试纸检测，10 min后观察结果。

1.3.6 试纸灵敏度检测

用重悬液配制DON质量浓度分别为1 000、500、250、125、62.5 ng/mL及40、20、10、5、2.5 ng/mL的标准品溶液用于检测试纸敏感性，胶体金免疫层析试纸通过裸眼及TSR3000读条仪判定结果；磁荧光免疫层析试纸通过荧光读条仪判定结果，两种试纸条均根据扫描峰面积，绘制标准曲线进行定量检测，计算50%抑制浓度（IC）衡量其灵敏度，以10%抑制浓度为试纸条的检出限。

1.3.7 试纸特异性检测

选取常见真菌毒素AFB、OTA、ZEN、FB、T-2作为交叉反应靶标物，各靶标物用甲醇配制成1 mg/mL母液，用相应稀释液稀释为10 μg/mL。分别用胶体金免疫层析试纸及磁荧光免疫层析试纸检测，确定试纸的交叉反应率，评价试纸特异性。

1.3.8 DON磁荧光试纸荧光信号稳定性检测

用磁荧光试纸检测重悬液，10 min后通过荧光读条仪读取试纸T线荧光信号，每隔5 min读取1 次，至反应40 min，通过峰面积分析荧光信号的稳定性。

1.3.9 加标样品检测

选用PBS配制DON标准溶液100 μg/mL，取阴性小麦样品5 份，粉碎后加入DON标准品，配制DON含量为1 000 μg/kg的小麦阳性样品（国标限量）。小麦阳性样品各取1 g/份于5 mL离心管中，加入2 mL PBS充分振荡提取15 min，10 000 r/min离心3 min，上清液稀释后用于DON磁荧光试纸检测，每份样品重复检测3 次求取平均值计算小麦样品中所含DON质量浓度，计算添加回收率及变异系数，评价DON磁荧光免疫层析试纸的准确性及精密度。

1.4 数据处理

从检测仪器中导出数据及图片，采用Excel进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 超顺磁颗粒的表征

分别调整反应体系中三氯化铁及柠檬酸钠使用量，改变磁性颗粒的粒径，结果见表1，保持整个体系其他成分不变时，磁颗粒粒径随着反应体系中三氯化铁所占比例增加磁颗粒的粒径增大。磁颗粒分布见图1，结合图1及表1结果显示，1号磁颗粒的分布峰更窄，标准偏差更小，从而说明1号磁颗粒径均一性更好。对1号磁性颗粒进行透射电镜扫描结果见图2，结果显示磁纳米颗粒呈现规则的球体。磁力鉴定实验结果显示：在外加磁场作用下，磁颗粒可在1 min内被完全吸附于瓶底，说明制备的磁颗粒具有较好的磁性，可以用于后期靶标物的富集检测。

表1 磁性颗粒粒径变化规律Table 1 Particle size variation of magnetic microspheres

图1 超顺磁纳米颗粒的粒径分布Fig. 1 Particle size distribution of superparamagnetic nanospheres

图2 1号超顺磁颗粒的透射电子显微镜扫描图Fig. 2 TEM image of superparamagnetic microspheres

2.2 DON磁荧光抗体探针鉴定及优化

磁荧光抗体探针的磁性鉴定结果见图3A，结果显示在外加磁场作用下磁颗粒在1 min内可以完全被吸附于反应杯底部，说明探针具有很好的磁性；探针免疫学及荧光性能鉴定结果见图3B及3C，结果显示磁荧光抗体探针可以被NC膜上固定的SPA拦截，说明磁颗粒与DON单克隆抗体偶联成功，且具有很好的活性；磁荧光抗体探针的荧光特性鉴定结果见图3C，将图3B中试纸用荧光读条仪扫描，结果显示，在SPA拦截线位置有较强的荧光信号。综上所述本实验通过一步法偶联的DON磁荧光抗体探针制备成功。

图3 DON磁荧光抗体探针的鉴定Fig. 3 Identification of DON magnetic fluorescent antibody probe

DON磁荧光抗体探针制备过程中优化了绿色荧光蛋白及DON单克隆抗体的加入量，结果见图4。当200 μL磁珠中加入蛋白量低于1.25 μg时，磁吸附上清液中荧光信号完全消失（吸附接近100%），随着蛋白量的增加，磁珠吸附荧光值快速增加，吸附比逐渐下降。当蛋白加入量达到5 μg时，吸附比仅为40.87%，有超过一半的荧光信号残留于上清液中，说明蛋白加入已经过量，但5 μg时吸附荧光值远大于2.5 μg时，因此确定每200 μL磁珠中加入5 μg蛋白为较优蛋白量。

图4 DON磁荧光抗体探针标记蛋白加入量优化Fig. 4 Optimization of protein concentrations for DON magnetic fluorescent antibody probe

2.3 试纸灵敏度的检测

DON磁荧光免疫层析试纸裸眼观测结果见图5A，用荧光读条仪扫描获得荧光曲线见图5B，利用峰面积值绘制标准曲线，回归方程为-0.562+0.921，=0.990，经计算试纸定量的IC为5.611 ng/mL，检出限为1.089 ng/mL；DON胶体金免疫层析试纸灵敏度的结果见图6，裸眼检测灵敏度为500 ng/mL（图6A）；利用读条仪扫描灰度曲线为图6B，根据峰面积绘制标准曲线，回归方程为-0.543+1.485，=0.991，经计算试纸定量的IC为65.16 ng/mL，检出限为11.94 ng/mL。比较两种方法的IC，结果显示DON磁荧光免疫层析试纸是胶体金免疫层析试纸灵敏度的10.96 倍。

图5 磁荧光免疫层析试纸灵敏度Fig. 5 Sensitivity of magnetic fluorescent immunochromatographic test strip

图6 DON胶体金免疫层析试纸灵敏度Fig. 6 Sensitivity of colloidal gold immunochromatographic test strip

2.4 试纸特异性的检测

表2 DON免疫层析试纸特异性鉴定结果Table 2 Specificity identification of test strips

表2显示：DON胶体金免疫层析试纸与常见真菌毒素AFB、OTA、ZEN、FB、T-2交叉反应率低于0.65%，DON磁荧光免疫层析试纸与常见真菌毒素AFB、OTA、ZEN、FB、T-2交叉反应率低于0.06%，说明本实验建立的两种DON免疫层析试纸具有很好的特异性。

2.5 DON磁荧光试纸荧光信号稳定性检测

由于DON磁荧光免疫层析试纸跑板需要8～10 min，为了在干净的背景下观测荧光信号，因此选择10 min后进行磁荧光信号稳定性检测，结果见图7，荧光信号随着时间的延长呈明显下降的趋势。因此应严格控制试纸结果判定时间，在试纸检测10 min左右读取结果。

图7 磁荧光试纸荧光信号稳定性Fig. 7 Stability of fluorescence signal of magnetic fluorescent test strip

2.6 DON磁荧光试纸加标回收实验

检测DON加标阳性小麦样品5 份，实验结果见表3。添加回收率在81.447%～98.558%之间，平均值为87.378%；变异系数在14.462%～19.662%之间，平均值为17.351%，均小于20%，说明该检测方法具有很好的准确性和精密度。

表3 加标回收实验结果（n=3）Table 3 Recoveries of magnetic fluorescent immunochromatographic test strip for DON in spiked wheat samples (n = 3)

3 讨 论

尽管荧光免疫层析试纸快速检测技术、免疫磁珠分离技术和磁性荧光复合材料制备技术已经非常成熟且被广泛应用，但综合以上技术的磁荧光免疫层析检测还鲜有报道，本研究将超顺磁颗粒与绿色荧光蛋白偶联制备磁性荧光纳米复合材料作为标记物应用于免疫层析试纸中，构建磁荧光免疫层析试纸技术模式，该模式兼具了免疫反应的特异性、磁颗粒的富集作用及荧光信号的高灵敏度，并成功应用于小麦中DON的检测，为高灵敏、更准确定量的免疫学快速检测提供技术启示及支撑。

在磁荧光免疫层析试纸检测时，将1 μL磁荧光抗体探针加入到300 μL的样品中反应，在外加磁场的作用下回收。由于投入的磁颗粒探针量较少，当样品体积超过300 μL后磁荧光抗体探针回收较困难，因此选择1 μL探针加入300 μL样品进行检测，100 μL重悬液重悬，等于将样品3 倍富集。选择磁性探针不仅可以浓缩样品，而且探针回收后统一用重悬液重悬，大大降低了试纸检测过程中不同样本的基质效应，让检测结果更准确。

由于超顺磁颗粒与荧光纳米材料偶联后出现荧光猝灭现象，因此在磁荧光纳米材料的制备过程中需要硅化处理及偶联等复杂的制备过程，技术门槛很高，限制了推广应用。本实验选取的绿色荧光蛋白，荧光性质稳定，从蓝光到紫外线都能使其激发，发出绿色萤光，采用一步法将磁颗粒、绿色荧光蛋白与抗体偶联制备磁荧光抗体探针，大大简化了磁荧光抗体探针的制备过程，降低了磁荧光纳米材料的技术门槛，为其更广泛的应用于免疫层析检测中提供技术手段。

4 结 论

采用溶剂热法成功制备了超顺磁颗粒，并采用一步法将其与绿色荧光蛋白及DON单克隆抗体偶联获得磁荧光抗体探针。通过优化实验参数，分别制备了DON磁荧光免疫层析试纸及DON胶体金免疫层析试纸，DON磁荧光免疫层析试纸可以实现样品的富集及荧光信号检测，灵敏度是DON胶体金免疫层析试纸的10.96 倍，可以实现DON的定量检测。该实验成功建立了磁荧光免疫层析试纸模式，并将其应用于DON检测中，为磁荧光纳米颗粒应用于免疫层析领域提供技术支撑。