刘悦鑫 ，田方东 ，李昕怡 ，熊 根 ，江祥宇 ，李 贤 ，李燕妮

（1）昆明医科大学法医学院，云南 昆明 650500;2）云南赢鼎司法鉴定中心，云南 普洱 665000）

东莨菪碱（Scopolamine）和阿托品（Atropine）均为临床常用的抗胆碱药物，常用于解痉、镇痛、止咳、平喘、中药麻醉等。它们是曼陀罗、天仙子、颠茄等茄科有毒植物中的主要毒性或活性成分[1]。阿托品中毒可出现视力模糊[2]、唾液分泌减少[3]、血管扩张[4]、心率不齐[5]和精神错乱等症状[6]，因此，它也可用作有机磷农药中毒的解毒剂。东莨菪碱是一种镇痛剂和肌肉松弛剂，为具有镇痛剂特性的解痉剂，广泛用于治疗运动性疾病和术前用药；但是，东莨菪碱也可通过降低胆碱乙酰转移酶的水平，减少乙酰胆碱的生成，导致短时认知和学习障碍[7]。曼陀罗是一种常见杂草，其茎、叶、种子中均含有东莨菪碱、阿托品、山莨菪碱等多种成分，收割小麦、玉米等粮食时，因混入曼陀罗植株或种子引起意外中毒的事件时有发生。目前，利用此类植物进行麻醉抢劫、投毒或作为替代毒品使用的案件也日益增多。因此，建立快速、准确测定曼陀罗中毒人体生物检材中东莨菪碱和阿托品等主要成分的定性定量检测方法，具有法医学意义。

目前的文献报道主要集中于检测植物中的东莨菪碱和阿托品，侯士果等[8]用HPLC 法测定洋金花中东莨菪碱和阿托品含量；佘彩蒙等[9]用UPLC-MS/MS 法测定全血中的东莨菪碱和阿托品；蒋运斌等[10]用UPLC-DAD 法测定野生山莨菪根中樟柳碱、东莨菪碱和阿托品含量；任小娜等[11]用毛细管电泳-电致化学发光法分离测定中药马尿泡中的托烷类生物碱成分。本文采用 LCMS/MS 法测定了误食曼陀罗种子中毒人体血液、尿液中东莨菪碱和阿托品的含量，为曼陀罗中毒的临床救治提供依据；也获得了曼陀罗种子中毒人体血液、尿液中东莨菪碱和阿托品的含量，丰富了曼陀罗中毒的法医毒理学数据。

1 材料与方法

1.1 实验仪器与试剂

LC-MS/MS（岛津LCMS-8040 三重四极杆液质联用仪），电子天平（赛多利斯BT125D），低温离心机（赛洛捷克 CF1524R），Milli-Q 纯水系统（美国）。

氢溴酸东莨菪碱标准品（上海卡努生物有限公司，纯度 为98% ）、>阿托品标准品（德国DR.EHRENSTORFER GmbH 公司，货号：CDCTC10333500，纯度为99.90%）、东莨菪碱N-氧化物（成都瑞芬思德丹生物科技有限公司，纯度为98%）；固相萃取柱（纳谱分析 SelectCoreTMC18）；乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯（Merck 公司），超纯水，其余试剂均为分析纯。

实验中使用的空白血液和尿液均采自本研究人员，且无东莨菪碱和阿托品等相关药物的摄入史。

1.2 实验方法

1.2.1 分析条件（1）液相条件：Shim-pack GISRHP C18 柱（2.1 mm×100 mm×3 µm）；柱温：36 ℃；流动相（A）：0.1% 甲酸水，流动相（B）：乙腈；进样量：1 µL；流速：0.3 mL/min 梯度洗脱，梯度洗脱程序，见表1；（2）质谱条件：东莨菪碱和阿托品的检测参数，见表2。

表1 梯度洗脱条件Tab.1 Gradient elution conditions

表2 东莨菪碱和阿托品的检测参数Tab.2 Detection parameters of scopolamine and atropine

1.2.2 标准品溶液的配制精密称取氢溴酸东莨菪碱12.67 mg，阿托品标准品10.0 mg，分别置于10 mL 容量瓶中，乙腈定容至刻度线，混匀，得到质量浓度为1.0 mg/mL 的东莨菪碱和阿托品标准储备液，贮存于4 ℃冰箱。分别取适量东莨菪碱和阿托品标准储备液，乙腈稀释后配制质量浓度为10 µg/mL，1.0 µg/mL，100 ng/mL 的东莨菪碱和阿托品的混标应用液。

精密称取东莨菪碱N-氧化物5 mg 于5 mL 容量瓶中，乙腈定容至刻度线，混匀，得到质量浓度为1.0 mg/mL 的东莨菪碱N-氧化物标准储备液，贮存于4 ℃冰箱。分别取适量标准储备液，乙腈稀释后配制质量浓度为10 µg/mL，1.0 µg/mL，100 ng/mL 的东莨菪碱N-氧化物应用液。

1.2.3 样品试液的制备（1）空白样品制备：分别准确量取空白人体静脉血液和空白尿液各36 份，每份1 mL，各加入1 mL 乙腈振荡提取后，低温高速离心（10 000 r/min，5 min），分别吸取上清液经有机滤膜（13 mm×0.22 µm）过滤，取适量滤液经乙腈稀释1 000 倍，得到空白血样和空白尿样；（2）案例样品制备：分别准确量取误食曼陀罗种子中毒人体静脉血、尿液各2 份，每份1 mL，按照1.2.3 空白样品处理方法处理后，得到待测血样和待测尿样。

1.3 统计学处理

采用 SPSS 19.0 统计软件对实验数据进行统计学处理，计量资料用均差±标准差（）表示，计数资料用百分比表示（%）。

2 结果

2.1 酸性流动相和碱性流动相比较

分别采用酸性流动相（乙腈-0.1%甲酸水溶液）和碱性流动相（乙腈-pH 10 氨水）检测东莨菪碱和阿托品，结果表明，采用酸性流动相既可满足组分分离度要求，又能提高东莨菪碱的检测灵敏度，故本实验选用乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相。

2.2 样品前处理方法比较

采用3 种萃取方法萃取空白人体静脉血添加样、空白人体尿液添加样中东莨菪碱和阿托品，比较3 种萃取方法的提取效率。

2.2.1 乙腈直接提取法分别准确量取1 mL 空白人体静脉血添加样品（10 ng/mL，50 ng/mL，100 ng/mL）、空白人体尿液添加样品（10 ng/mL，50 ng/mL，100 ng/mL）各2 份，加入乙腈沉淀蛋白、超声、离心、有机滤膜过滤得到空白血添加样A（10 ng/mL，50 ng/mL，100 ng/mL）和空白尿添加样A（10 ng/mL，50 ng/mL，100 ng/mL）。

2.2.2 液-液萃取法分别准确量取1 mL 空白人体静脉血添加样 品（10 ng/mL，50 ng/mL，100 ng/mL）、空白人体尿液添加样品（10 ng/mL，50 ng/mL，100 ng/mL）各2 份，分别加入适量丙酮：水（8∶2）浸泡过夜，离心，挥干上清液中丙酮后，用pH10 稀氨水调节pH，再以乙酸乙酯萃取，萃取液采用氮气吹干后，残渣用甲醇复溶，经有机滤膜过滤得到空白血添加样B（10 ng/mL，50 ng/mL，100 ng/mL）和空白尿添加样B（10 ng/mL，50 ng/mL，100 ng/mL）。

2.2.3 固相萃取法分别准确量取1 mL 空白人体静脉血添加样品（10 ng/mL，50 ng/mL，100 ng/mL）、空白人体尿液添加样品（10 ng/mL，50 ng/mL，100 ng/mL）各2 份，加入乙腈沉淀蛋白、超声、离心，上清液用pH10 稀氨水调节pH 后过C18 固相柱，采用甲醇洗脱，洗脱液经有机滤膜过滤得到空白血添加样C（10 ng/mL，50 ng/mL，100 ng/mL）和空白尿添加样C（10 ng/mL，50 ng/mL，100 ng/mL）。

2.2.4 不同萃取方法的回收率比较在1.2.1 分析条件下检测不同萃取方法萃取的空白血添加样A、B、C（10 ng/mL，50 ng/mL，100 ng/mL）、空白尿添加样A、B、C（10 ng/mL，50 ng/mL，100 ng/mL）和东莨菪碱和阿托品的混标溶液（10 ng/mL，50 ng/mL，100 ng/mL），分别以东莨菪碱和阿托品的定量离子对峰面积作为依据，获得乙腈直接提取法、液-液萃取法和固相萃取法萃取人体血液、尿液中的东莨菪碱和阿托品的提取效率，见表3～表5。

表3 3 种提取方法的提取率比较（高浓度）（%）Tab.3 Comparison of extraction rate of three extraction methods（high concentration）（%）

表4 3 种提取方法提取率比较（中浓度）（%）Tab.4 Comparison of extraction rate of three extraction methods（medium concentration）（%）

表5 3 种提取方法提取率比较（低浓度）（%）Tab.5 Comparison of extraction rate of three extraction methods（low concentration）（%）

结果表明，3 种提取方法中，乙腈直接提取法对人体血液、尿液中的东莨菪碱和阿托品均有较高的回收率。液-液萃取法因过程复杂导致提取率低。经对固相萃取的流出液和洗脱液中2 种目标物的分析，可能因C18 柱对东莨菪碱和阿托品的吸附能力不强，而样品液中有机溶剂极性较强，致使2 种目标物直接流出所致。综上所述，本研究采用乙腈直接提取法作为样品前处理方法。

2.3 专属性验证

在1.2.1 分析条件下检测空白溶剂乙腈、空白血样、空白尿样、东莨菪碱和阿托品混标溶液、空白血添加样、空白尿添加样。结果表明，空白溶剂、空白血样、空白尿样基质无干扰，方法专属性好，见图1。

图1 不同基质中东莨菪碱和阿托品色谱图Fig.1 Chromatogram of scopolamine and atropine in different matrix

2.4 线性考察

取适量10 µg/mL，1.0 µg/mL，100 ng/mL 的东莨菪碱和阿托品的混标应用液，分别用1.2.3 制备的空白血样和空白尿样配制系列浓度为1、5、10、20、40、50、60、80、100 ng/mL 的校准系列样品（每个浓度点配制2 个平行样），在1.2.1 分析条件下检测，以定量离子对的峰面积（A）平均值为纵坐标，浓度C（ng/mL）为横坐标进行线性回归，得到东莨菪碱和阿托品的线性方程分别为：东莨菪碱：血液A1=4 259.76* C-3 575.82（r2=0.999 0），尿液A2=3 723.90 * C-273.369（r2=0.999 2）；阿托 品：血 液A1=10 214.9 * C-5 579.76（r2=0.999 1），尿液A2=9 413.21* C+3 548.72（r2=0.999 1）。结果表明，不同基质中的东莨菪碱和阿托品质量浓度在1～100 ng/mL 范围内线性关系良好。

2.5 灵敏度考察

取2.4 线性最低点逐级稀释后测定，以信噪比（S/N）大 于3 作为检出限（limit of detection，LOD），以（S/N）大于10 作为最低定量限（limit of quantitation，LOQ），东莨菪碱和阿托品的检出限分别为：血液0.45 ng/mL 和0.19 ng/mL，尿液0.38 ng/mL 和0.16 ng/mL，最低定量限分别为：血液1.01 ng/mL 和0.63 ng/mL，尿液1.07 ng/mL和0.38 ng/mL。

2.6 精密度试验

分别配制质量浓度为10、40、80 ng/mL 的东莨菪碱和阿托品空白血添加样和空白尿添加样，每个浓度点制备6 个平行样品，按照2.2.1 处理后，在1.2.1 分析条件下连续测定6 次，连续测定7 d。采用相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）来评估精密度，要求添加样品的精密度（RSD）应小于15%。东莨菪碱和阿托品的日内及日间精密度见表6、表7。2 种目标物的日内精密度为1.71%～4.36%，日间精密度为3.87%～5.9%，精密度均小于6%（在15%以内），表明方法的精密度良好。

表6 人体血液和尿液中东莨菪碱和阿托品的日内精密度（RSD）Tab.6 Intra day precision of scopolamine and atropine in human blood and urine（RSD）

表7 人体血液和尿液中东莨菪碱和阿托品的日间精密度（RSD）Tab.7 Inter day precision of scopolamine and atropine in human blood and urine（RSD）

2.7 准确度试验

准确度采用测定值与实际添加标准样品的质量分数的百分比表示，规范要求添加样品的准确度应在85%～115%。将2.6 检测得到的各样品峰面积，经线性方程计算获得各样品中2 种目标物的测定值，再计算准确度，见表8。结果表明，血液中东莨菪碱和阿托品的准确度为：89.83%～101.9%；尿液中2 种目标物的准确度为：89.38%～102.86%，精密度均在85%～115%以内，表明方法的准确度良好。

表8 东莨菪碱和阿托品的准确度Tab.8 Accuracy of scopolamine and atropine

2.8 稳定性试验

取适量的空白人体静脉血和尿液，加入不同浓度的东莨菪碱和阿托品混标应用液，配制得到低，中，高浓度（10、40、80 ng/mL）的空白血和空白尿添加样，分别放置36 h 和4 周后，按照2.2.1 处理后，在1.2.1 分析条件下检测低，中，高浓度（10、40、80 ng/mL）的空白血和空白尿添加样后，计算偏倚值（以测定平均值和参考值的差值与参考值的百分比表示），见表9、表10。结果表明，东莨菪碱和阿托品在血液和尿液中的偏倚值为0.10%～4.88%，在规范要求的15% 以内，说明2 种目标物在血液、尿液中稳定性良好。

表9 室温放置36 h 后人体血液和尿液中东莨菪碱和阿托品的稳定性试验Tab.9 Stability test of scopolamine and atropine in human blood and urine after 36 hours at room temperature

表10 4 ℃冰箱放置4 周后人体血液和尿液中东莨菪碱和阿托品的稳定性试验Tab.10 Stability test of scopolamine and atropine in human blood and urine after 4 weeks in 4 ℃ refrigerator

2.9 基质效应

分别用1.2.3 制备的空白血样和空白尿样，加入适量东莨菪碱和阿托品的混标应用液，配制低，中，高浓度（10、40、80 ng/mL）的空白血添加样、空白尿添加样（基质后加标样）。同时，配制低，中，高浓度（10、40、80 ng/mL）的混标溶液。在1.2.1 分析条件下检测，分别测得空白血添加样、空白尿添加样中目标物定量离子对峰面积B，混标溶液中对应目标物及浓度的峰面积A，采用计算基质效应（%），见表11。结果表明：2 种目标物在血液、尿液基质中的基质效应为-3.51%～0.84%（在规定值 ±25%以内）；相对标准偏差（RSD）小于2%，说明目标物受基质效应影响较小。

表11 东莨菪碱和阿托品在人体血液和尿液中的基质效应Tab.11 Matrix effects of scopolamine and atropine in human blood and urine

2.10 案例样品测定

案例为1 名65 岁女性，因误食曼陀罗种子后出现头晕、头痛、烦躁、瞳孔散大、共济失调、血压上升、幻觉等中毒症状，送至医院时已经中毒3 h，医院依据家属提供信息，采集中毒者的静脉血和尿液委托进行曼陀罗中毒性成分检测。在1.2.1 分析条件下检测1.2.3 制备的待测血样和待测尿样，分别以空白血添加样、空白尿添加样为参比，以保留时间、2 对离子对离子丰度比的相对误差进行待测血样和待测尿样中东莨菪碱和阿托品的定性分析，以定量离子对峰面积为定量依据，采用校准曲线法进行待测血样和待测尿样中东莨菪碱和阿托品的定量分析，测定值经换算后得到案例检材中东莨菪碱和阿托品的含量，见表12。

表12 案例样品中2 种目标物的含量（µg/mL）Tab.12 Contents of two target substances in case samples（µg/mL）

3 讨论

本研究比较了酸性流动相（乙腈-0.1%甲酸水溶液）和碱性流动相（乙腈-pH 10 氨水）对色谱峰峰型、出峰时间、分离效果、灵敏度的影响，结果显示，采用酸性流动相（乙腈-0.1%甲酸水溶液）测定，能有效分离东莨菪碱和阿托品（保留时间分别为2.711 min 和 2.876 min），峰形良好，灵敏度高，对色谱柱损害小。同时还考察了乙腈直接提取法、液-液萃取法和C18 柱固相萃取法萃取人体血液和尿液中东莨菪碱和阿托品的效果，结果表明：检材中目标物含量较高时，检材用量减少，乙腈直接提取法的萃取效率和基质效应优于液-液萃取和固相萃取。本研究建立的东莨菪碱和阿托品的LC-MS/MS 检测方法，能快速、准确的测定人体检材中东莨菪碱和阿托品的含量，能满足曼陀罗、东莨菪碱、阿托品中毒案事件的定性定量检测要求。

分析本案例检测结果，血液和尿液中东莨菪碱的浓度差异较小，而尿液中阿托品的浓度为血液中的87 倍，这可能与东莨菪碱和阿托品的分子结构、理化性质以及半衰期等因素有关。该结果说明阿托品主要以原药从尿液中排除，因此，涉及该类毒物中毒的检验，尿液为检测阿托品的重要检验材料。此外，本研究也对案例检材血液、尿液中的东莨菪碱主要代谢物-东莨菪碱N-氧化物（Scopolamine N-oxide）进行检测，但未检测到东莨菪碱N-氧化物，具体原因有待进一步研究。综上所述，本研究为临床诊治提供依据，同时也丰富了曼陀罗中毒的法医毒理学实验数据。