马 亮，董 靖，张国栋，张露珊，刘绍春，艾晓辉

(1.华中农业大学水产学院，武汉 430070；2.中国水产科学研究院长江水产研究所，武汉 430223；3.岳阳渔美康生物科技有限公司，湖南岳阳 414100)

克氏原螯虾()俗称小龙虾，在我国大部分省份均有分布，其中在江苏、安徽、湖北、湖南、江西等省份产量较大，是我国重要的淡水经济养殖品种。2020年全国克氏原螯虾总产量约为239.37万吨，总产值约3 448.46亿元。近年来，克氏原螯虾养殖规模不断扩大，导致养殖环境恶化，病害日趋频繁和严重，影响了克氏原螯虾的健康养殖，造成了严重的经济损失。国内外相继报道了引起克氏原螯虾疾病的病原有白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)、弗氏柠檬酸杆菌()、维氏气单胞菌()、副溶血弧菌()和螺旋体()等。

克氏原螯虾养殖进入5月份后，随着水温升高水体中病原菌的数量迅速上升，毒力和感染能力增强，极易引起克氏原螯虾爆发疾病，俗称为“五月瘟”。克氏原螯虾爆发“五月瘟”，发病速度快且死亡率高，常规用药治疗效果不显著。因此，探明克氏原螯虾“五月瘟”的发病原因，选择较为敏感的治疗药物，对降低患病虾死亡率具有重要意义。

普通变形杆菌()是肠杆菌科的一种革兰氏阴性菌，在自然界分布广泛，水、土壤、腐败的有机物以及人或动物肠道内都有发现，是一种人畜共患的条件致病菌，此外，该菌也是一种重要的水产动物病原菌，可感染斑点叉尾鮰()、加州鲈()、罗非鱼(spp)、大口鲶(Chen)、中华鳖()、对虾()等水产养殖动物，但该菌对克氏原螯虾的致病性还未见报道。2019年湖北省潜江市某养殖场爆发“五月瘟”，本研究从患病克氏原螯虾肝胰腺分离纯化出一株致病菌，鉴定为普通变形杆菌，通过药敏试验测定了该菌株对常见抗菌药物的敏感性。此外，还研究了氟苯尼考与天然化合物联用的协同抑菌作用，以期为普通变形杆菌引发的克氏原螯虾细菌性感染提供治疗方案和策略。

1 材料与方法

1.1 试验材料

克氏原螯虾病虾来自潜江市某小龙虾养殖基地，LB培养基购自青岛海博生物公司，药敏纸片购自北京三药科技开发公司，细菌基因组DNA小量纯化试剂盒购自宝日医生物技术有限公司，PCR Master MIX购自南京诺维赞生物科技有限公司。

1.2 细菌分离及纯化

在无菌条件下，取患病克氏原螯虾的肝胰腺用无菌玻璃匀浆器匀浆后，接种至LB固体培养基上，在37 ℃恒温培养16 h，挑取疑似菌落纯化3次，纯化后的菌落记为QJ201905007，在LB液体培养基中 37 ℃震荡培养16 h后，加入无菌甘油，放至-80 ℃保存备用。

1.3 分离菌株鉴定

1.3.1 优势菌株的理化特性

将革兰氏染色后的QJ201905007置于光学显微镜下，对其形态特征进行初步鉴别和观察。将新鲜菌液在无菌生理盐水中重悬后接种于API20E生化鉴定试剂条中，将试剂条放置于培养箱中培养过夜，在ATB32GN细菌鉴定系统中鉴定。

1.3.2 分离菌株的分子鉴定

按TaKaRa MiniBEST Bateria Genomic DNA Extraction Kit操作说明提取分离株QJ201905007的基因组DNA，将提取的基因组和16S rRNA通用引物加入到PCR扩增体系中，扩增16S rRNA的基因片段。引物序列如下，F：5′-AGAGTTTGATCA TGGCTC-3′，R：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。扩增结束后取5 μL PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。将有目的条带的PCR产物进行测序，测序所得到的基因序列提交至BLAST同源性比对软件进行分析，使用MEGA6软件采用Neighbor-Joining法构建进化树，通过分析Bootstraps法检测1 000次，分析QJ201905007菌株的分类地位。

1.4 分离菌株对克氏原螯虾的毒力试验

回归感染试验在长江水产研究所渔药临床试验中心动物实验室进行，所用克氏原螯虾平均约25 g/只暂养于1 m×0.6 m×1 m的水族缸中，以充分曝气后的井水作为水源，保持水温(25±2) ℃，溶氧5 mg/L以上，水深4～6 cm，水族箱内设置PVC管和水草等掩蔽物，试验前暂养5～7 d。用接种环挑取QJ201905007的单菌落接种至LB培养基中，放置摇床37 ℃震荡培养12 h。收集菌体用无菌生理盐水洗涤3次后重悬，然后用无菌生理盐水依次稀释至浓度为1.5×10、1.5×10、1.5×10、1.5×10和1.5×10CFU/mL。各试验组分别于克氏原螯虾的关节软膜处注射200 μL的菌液，对照组注射200 μL的无菌生理盐水，30尾为一组。记录每组死亡状况，连续观察8 d。采用Bliss法计算其半数致死浓度(LC)。同时从濒死的克氏原螯虾肝胰腺等组织中分离病原菌并进行鉴定。

1.5 患病克氏原螯虾病理学观察

人工感染后，观察患病的克氏原螯虾的症状，并进行剖检观察其肝胰腺和肠道内变化。取其肝胰腺经4%多聚甲醛溶液固定后，进行石蜡包埋、切片制作、HE染色、切片成像和组织病理学分析。

1.6 药物敏感性试验

通过K-B法研究QJ201905007菌株对选取的23种抗菌药物的敏感性。用接种环挑取QJ201905007的单菌落，将其接种至LB液体培养基中，放至摇床(37 ℃，180 r/min)培养过夜，将新鲜菌液收集至离心管中离心后倒掉上清，用无菌PBS洗三次，再用无菌PBS将菌体重悬，用麦氏比浊管将菌液调至1.5×10CFU/mL，将100 μL菌液均匀涂抹在LB平板上，每个平板贴4张药敏片，每种药物重复3次，37 ℃培养12～16 h后测定抑菌圈直径。敏感性结果判定参照该公司药敏片试剂盒说明书上提供的判定标准。

近年来的研究表明，熊果酸、齐墩果酸具有多种生物活性[28～30]。熊果酸具有镇静、抗炎、增强机体免疫力、抗菌、美白、抗癌、抗糖尿病、抗溃疡和降低血糖等多种功效。齐墩果酸具有消炎、抑菌、降转氨酶、对四氯化碳引起的大鼠急性损伤有明显的保护等作用；此外，齐墩果酸还有促进肝细胞再生、防止肝硬化、强心、利尿、升白、降血酯、降血糖、增强机体免疫功能和抑制变态反应等作用。

1.7 联合药敏试验

筛选出天然化合物能够降低化学抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC)，可延长现有化学药物使用寿命。氟苯尼考是受试药物中敏感性较差且较为常见的国标兽药。依据肉汤微量稀释法测定了氟苯尼考以及天然化合物白藜芦醇、二氢辣椒碱、香叶木素、山奈酚、麝香草酚、虎杖苷、木犀草苷和桑色素单独使用时对QJ201905007菌株的MIC。

采用棋盘法研究氟苯尼考和另外8种不同天然化合物联合后对QJ201905007分离株的联合抑菌作用。向96孔板中注入100 μL LB液体培养基后，再加入氟苯尼考和天然化合物，使氟苯尼考浓度从第2孔到第10孔(从左到右)依次降低，天然化合物从B到H孔(从上到下)依次降低。将菌株培养至对数生长中期，离心收集菌体，无菌PBS洗三次，再用无菌PBS将菌体重悬，用麦氏比浊法调整菌液浓度至5×10CFU/mL，再每孔100 μL加到96孔板中，混匀后放置于37 ℃培养箱中培养12～16 h，分别设置阴性对照(只含培养基)和阳性对照(菌液和培养基)。联合抑菌作用采用抑菌浓度指数FICI评价，计算公式如下：FICI=MIC/MIC+MIC/MIC，FICI≤0.5为协同作用(SYN)；0.54为拮抗作用(ANT)。

2 结果

2.1 QJ201905007菌株的培养与形态特性

发病虾采食量下降、活动力较差，经剖检发现其肝胰腺坏死，有积水，肠道中食物残渣较少、出现烂尾现象。通过解剖患病的克氏原螯虾，在其肝胰腺中分离到一株优势菌，命名为QJ201905007。该优势菌在LB平板上呈乳白色菌落，表面光滑湿润。

2.2 QJ201905007菌株的生化特征

该优势菌经革兰氏染色后为短杆状的革兰氏阴性菌，菌株QJ201905007的生化鉴定结果如表1所示。将结果输入至ATB鉴定系统中发现QJ201905007的生化特征符合普通变形杆菌的特征。

表1 QJ201905007生化鉴定结果Tab.1 Biochemical characterization of the QJ201905007

2.3 QJ201905007菌株分子鉴定结果

通过BLSAT软件比对分析发现，菌株QJ201905007分子鉴定的序列(OK217109)与GenBank中已报道的普通变形杆菌序列相似度为99%，通过MEGA软件构建系统发育树，如图1所示，可发现分离菌株QJ201905007与普通变形杆菌聚为一支。结合以上实验结果可判定QJ201905007为普通变形杆菌。

图1 QJ201905007菌株16S rRNA系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree of QJ201905007 based on 16S rRNA gene sequence

2.4 QJ201905007菌株回归感染试验结果

不同剂量的QJ201905007菌株感染健康的克氏原螯虾，连续观察8 d。结果如表2所示，各剂量组感染后，克氏原螯虾出现了不同程度死亡现象，随着浓度下降，死亡率也随之下降。1.5×10CFU/mL高浓度感染组，在4 d后的死亡率为100%。死亡后的克氏原螯虾经解剖后发现其肝胰腺有积水且有部分坏死，细菌分离再次发现了与原菌株形态相同的菌落，经测序和比对发现分离到的细菌16s rRNA序列与QJ201905007序列同源性为100%。通过Bliss法计算，可得出菌株QJ201905007对克氏原螯虾的LC为5.04×10CFU/mL。

表2 QJ201905007菌株感染健康克氏原螯虾的死亡情况Tab.2 Deaths of healthy P.clarkia infected with QJ201905007

2.5 QJ201905007菌株感染克氏原螯虾的病理学观察

图2 克氏原螯虾主要组织病理变化Fig.2 Pathological changes of P.clarkii infected with QJ201905007a为正常虾的解剖图；b为病虾的肠道解剖图；c为病虾的鳃部解刨图；d-f为病虾的肝胰腺病理切片

2.6 QJ201905007菌株的药敏试验结果

如表3所示，QJ201905007菌株对亚胺培南、头孢噻肟、恩诺沙星和头孢吡肟4种药物敏感；对新霉素、多西环素和四环素等5种药物中度敏感；对氟苯尼考、链霉素和丁胺卡那等14种药物耐药。

表3 药敏试验结果Tab.3 The results of the drug sensitivity test

2.7 联合药敏试验结果

由表4可知，氟苯尼考对QJ201905007菌株的MIC为64 μg/mL。受试的8种天然化合物中，白藜芦醇和二氢辣椒碱对QJ201905007有一定的抑制作用，MIC分别为32和64 μg/mL。当联合用药时，仅有白藜芦醇与氟苯尼考具有协同作用，并且白藜芦醇与氟苯尼考MIC均下降了87.5%，其FICI为0.25。

表4 氟苯尼考与天然化合物(单独或联合)对QJ201905007分离株的最小抑菌浓度Tab.4 The MICs of florfenicol and natural compounds(alone or combination) against QJ201905007 isolate

3 讨论

普通变形杆菌是一种条件致病菌，广泛存在于土壤和污水等自然环境中，以及人和动物的肠道中，可引起人类疾病的报道较多，主要有食物中毒、创伤性感染，颅骨骨髓炎和尿道感染等，对人类健康危害较大。其致病机理是通过菌毛黏附到宿主细胞上，并快速滋生鞭毛及形成生物膜，在宿主细胞内产生多种毒力因子，从而引起宿主发病。

近年来，随着水产养殖业的快速发展，普通变形杆菌引发细菌性疾病的报道逐渐增多。杨移斌等的研究中发现斑点叉尾鮰感染普通变形杆菌后，鱼体表轻微溃烂，肛门有淡黄色液体流出，脾肾轻微充血，肠道严重糜烂坏死等症状。普通变形杆菌感染可引起加州鲈肝脏充血、肠道溃烂。罗氏沼虾()感染普通变形杆菌后，病虾躯体与附肢变红，鳃部变黄且出现大水泡，眼睛凹陷或脱落。本试验中克氏原螯虾感染普通变形杆菌后，其主要症状表现在肝胰腺和肠道等器官。此外，普通变形杆菌是一种人-兽-鱼共患病原菌，尽管目前尚无普通变形杆菌通过水产品感染人类的报道，但随着水产动物普通变形杆菌感染报道的增多和人类消费水产品的增多，水产品中存在的普通变形杆菌可能在流通和加工等过程感染人类。因此，加强水产养殖动物普通变形杆菌的控制不仅可降低该菌感染导致的经济损失，还可提高水产品质量安全，减少对人类健康的威胁。

目前对于防控普通变形杆菌引起的细菌性疾病，主要还是以抗生素为主。罗珊等研究表明，临床分离的人源68株普通变形杆菌对头孢唑林、复方磺胺甲噁唑耐药率高。路振香等从牛和猪体内分离出两株普通变形杆菌对头孢菌素类药物高度耐药。以上研究表明，临床分离的普通变形杆菌对某些药物具有一定的耐药性。本研究发现菌株QJ201905007对多种抗菌药物耐药，与以往的报道具有相似性；但其敏感性又有一定差异，可能与用药习惯有关，因此在用药过程中建议及时开展药敏试验，选择较为敏感的药物进行治疗，严格按照剂量和疗程使用药物。

“五月瘟”是克氏原螯虾在5月份爆发性疾病的一个俗称，其发病原因可能与多个因素相关，如病原菌、病毒、水质等，但目前没有统一的定论。陈昌福等认为，可能是致病性病毒和细菌共同感染的感染结果。兰江风等对湖北省5个主养区克氏原螯虾WSSV的感染率进行了调查，对外表无明显病变克氏原螯虾进行采集，但结果发现80%以上克氏原螯虾都携带有WSSV，提出克氏原螯虾是WSSV的重要携带者。本课题组前期通过ELISA法对采集的发病小龙虾样品进行病毒检测，未在发病虾体内发现WSSV存在。已有研究发现，弗氏柠檬酸杆菌、副溶血弧菌、维氏气单胞菌等均能导致克氏原螯虾发病，并引起严重的死亡，提示病原菌可能为“五月瘟”的发病因素之一。本试验中普通变形杆菌感染克氏原螯虾发生于5月份，是“五月瘟”的暴发季节，而且感染该病原的虾发病严重，死亡率极高。因此，推断该菌是克氏原螯虾“五月瘟”的病原菌之一。

本试验所分离的普通变形杆菌QJ201905007对23种抗生素敏感特性试验发现，分离菌株QJ201905007对亚胺培南、头孢噻肟、恩诺沙星和头孢吡肟4种抗生素高度敏感，对氟苯尼考、多粘菌素B、阿莫西林等14种抗生素耐药。对恩诺沙星高度敏感，这与黄杰等研究一致；对氟苯尼考、卡那霉素、庆大霉素耐药，与柯文杰等研究相反。根据联合药敏试验，结果发现，8种天然化合物，仅有白藜芦醇与氟苯尼考有协同抑菌作用。小龙虾养殖过程中应遵循“预防为主，治疗为辅”的疾病防控策略，日常调控好水质，减少应激，一旦发生细菌感染应首先消毒并辅以微生态制剂调节水质，若以上措施无效再选择适当的抗菌药物治疗。但小龙虾的养殖周期较短，在选择药物时要慎重，除了考察药物敏感性以外还应注意其休药期，用药后的小龙虾在休药期结束后再捕捞上市。本试验中的药敏试验结果可为防治克氏原螯虾普通变形杆菌病提供理论依据。