李福森，张 勇，宋吉玲，高 伟，王战伟，王雨亚，陈丽娜

(1.长春师范大学中心实验室，吉林 长春 130032；2.遵义市红花岗区南关中学，贵州 遵义 563000)

蒲公英是菊科、蒲公英属Taraxacum草本植物，可食药两用，且资源丰富。植株包括根、茎、叶、花和种子[1-2]。据报道，蒲公英属植物遍及世界各地，数量约2 000多种，我国有70种左右[3]。蒲公英性寒，味苦、甘，对疔疮肿毒、乳痈、目赤、咽痛、肺痈等症的治疗效果较好[4]。现代药理学研究表明，其具有抗炎、抗癌、抗高血糖、消肿散结等功效[5-8]。蒲公英中含有多种化学成分，主要包括黄酮类、甙类、萜类、酚类、胆碱等[9]。在其全草中，黄酮类化合物含量丰富，黄酮类具有较好的抗氧化、抑菌、延缓衰老和提高免疫力等作用[10]。

对中草药中的化学成分进行研究，提取过程较为关键，相对于回流、煎煮法等传统提取方法，更高效便捷的超声、微波提取等应用也愈加广泛[11]。其中，超声提取利用空化、振动搅拌、高速粉碎等作用，使组织破壁、分解，达到细胞中有效成分迅速溶于溶剂的目的[12-13]，在中药有效成分提取中应用较多[14]。

黄酮类化合物作为蒲公英中含量较高的成分，对其进行深入研究具有一定的现实意义[15]。目前，关于蒲公英中不同部位的总黄酮提取的研究相对较少。本文以蒲公英的叶、生根和熟根为研究对象，通过回流法及超声法提取蒲公英中有效成分，利用正交实验优化总黄酮提取的最佳条件，为蒲公英中黄酮类成分的开发利用提供一定的实验依据。

1 实验材料及仪器

蒲公英生根、熟根和叶来源于吉林省延边州安图县新合恒源蒲公英生产专业合作社(7月份采摘)；芦丁标准品购自Sigma 公司，纯度大于99%；95%乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝等试剂，购自北京精细化学品有限公司。

FA1204A电子分析天平(德国赛多利斯公司)；DU800紫外分光光度计(美国 Beckman 公司)；KH-250DB 数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；ZUOT-SYG4数显恒温水浴锅(上海比朗仪器有限公司)；FW-100高速万能粉碎机(北京中兴伟业仪器有限公司)。

2 实验方法

2.1 样品制备

精密称取蒲公英样品粉末(叶、生根或熟根)约1 g(准确至0.001 g)，加入适量乙醇溶液，进行超声或回流提取，过滤，滤液减压回收， 95%的乙醇定容至 10 mL，得到不同的蒲公英总黄酮提取物，放入 4℃冰箱保存，待测。

2.2 总黄酮含量测定

以芦丁为标准品，采用亚硝酸钠-硝酸铝法测定蒲公英中总黄酮含量，分别移取0.5 mg/mL芦丁标准液 0，0.02，0.04，0.06，0.08 和 0.10 mL 于 6支离心管中，依次加入 5% NaNO260 μL、无水乙醇400 μL，混匀后放置 5 min。继续加入60 μL 10% 的Al(NO3)3，混匀，放置 5 min。加入 1 mol/L NaOH，混匀，放置10 min。在波长510 nm下测吸光度A，平行3次。以芦丁的质量浓度(mg/mL)为横坐标， 吸光度为纵坐标绘制标准曲线。总黄酮含量为提取物中总黄酮在粗提物中的质量百分比。

2.3 正交实验设计

2.3.1 超声提取法正交实验

参考单因素实验结果，选择料液比、乙醇体积分数、占空比、超声功率和超声时间5个考察因素，每个因素选取4个水平进行正交实验，因素与水平编码如表1所示。采用正交实验优化超声法提取寒地蒲公英叶、生根和熟根中总黄酮的实验条件。

表1 超声提取法正交实验因素与水平编码表

2.3.2 回流提取法正交实验

参考单因素实验结果，选择料液比、乙醇体积分数、回流时间、回流次数和回流温度5个考察因素，在每个因素选取4个水平进行正交实验，因素与水平编码如表2所示。采用正交实验优化回流法提取寒地蒲公英叶、生根和熟根中总黄酮的实验条件。

表2 回流提取法正交实验因素与水平编码表

3 实验结果与分析

3.1 标准曲线绘制

以芦丁质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，方程为y=2.818 9x+0.212 9，回归系数r为0.998 1。在0.024～0.071 μg/mL范围内，质量浓度与吸光度呈现良好线性关系。

3.2 优化超声法提取蒲公英中总黄酮条件

分别采用正交实验优化蒲公英叶、生根和熟根中总黄酮提取的条件，以蒲公英熟根的正交实验结果进行说明和分析。直观分析法见表3，比较5个因素的R值，表明料液比是最主要影响因素，其他因素的影响程度依次为占空比、超声时间、超声功率和乙醇体积分数，蒲公英熟根中总黄酮提取的最优方案是A2B2C4D4E3，既料液比为1∶20 g/mL、乙醇体积分数为70%、占空比为 100%、超声功率为100 W、超声时间为40 min。方差分析结果表明(表4)，去掉最大误差项B后做方差分析，在其余4个因素中，只有A的P值小于0.05，其影响达显著水平。根据F值可知，影响蒲公英熟根中总黄酮得率因素的主次顺序为A、C、E、D，与直观分析结果一致。

表3 正交实验结果及直观分析

表4 方差分析结果

根据正交实验结果，蒲公英叶中的总黄酮提取最优方案是A2B1C3D4E1，既料液比为1∶20 g/mL、乙醇体积分数为60%、占空比为80%、超声功率为100 W、超声时间为25 min，有利于蒲公英叶中总黄酮的提取。蒲公英生根中的黄酮提取的最优方案是A1B3C1D1E1，既料液比为1∶10 g/mL、乙醇体积分数为80%、占空比为40%、超声功率为40 W、超声时间为25 min。

3.3 优化回流法提取蒲公英中总黄酮条件

采用正交实验优化回流法对蒲公英叶、生根和熟根中总黄酮的提取条件，以蒲公英叶中总黄酮提取的正交实验结果进行说明和分析。根据表5的数据，通过直观分析比较5个因素的极差R值，发现料液比是影响蒲公英叶中总黄酮提取效果的最重要因素，其他因素的影响程度依次为乙醇体积分数、回流温度、回流时间和回流次数。通过正交实验确定最佳提取方案是A4B4G1H2I4，既在料液比为1∶40 g/mL、乙醇体积分数为90%、时间为30 min、提取为2 次、回流温度为90℃时，有利于蒲公英叶中总黄酮得率提高。通过方差分析(表6)可知，去掉最大误差项H(回流次数)，其余4种因素中只有A(料液比)的P值小于0.01，说明其影响极显著。从各因素的F值可得出，影响蒲公英叶中总黄酮得率因素的主次顺序为A、B、I、G，与直观分析结果一致。

表5 正交实验结果及直观分析

表6 方差分析结果

根据正交实验结果，蒲公英生根中的总黄酮提取的最优方案A4B2G3H2I4，即在料液比1∶40 g/mL、回流时间60 min、乙醇体积分数70%、回流温度90℃，提取2 次，有利于蒲公英生根中总黄酮的提取。而蒲公英熟根中总黄酮提取的最佳方案为A2B3G3H4I1，在料液比为1∶20 g/mL、乙醇体积分数为80%、回流温度为60℃、提取4次，每次回流60 min，在熟根中所提取的总黄酮含量较高。

3.4 超声和回流提取方法对蒲公英不同提取物中总黄酮含量影响

根据上述优化后的提取条件，分别采用超声提取法和回流提取法对蒲公英生叶、生根和熟根中总黄酮进行提取，平行3次，结果如表7所示。

表7 不同提取方法对蒲公英中总黄酮含量影响

结果表明，回流法更有利于蒲公英叶中总黄酮提取，而超声法提取蒲公英生根和熟根中总黄酮含量更高。导致这种情况的原因可能由于叶与根的细胞结构不同，提高温度更有利于叶中黄酮类化合物的提取，而超声提取能够增强溶剂对于根细胞的穿透力，通过对物料细微局部进行撞击，促使植物组织破壁、分解，从而使细胞中的化学成分能够迅速进入溶剂相中，因此，超声提取的蒲公英生根和熟根中总黄酮含量远高于回流提取物。结果表明，超声法提取蒲公英中黄酮类化合物是一种迅速、高效的方法，更有利于蒲公英中黄酮资源的工业生产以及合理利用。

通过对比蒲公英叶、生根中总黄酮含量发现，生根中的总黄酮含量与叶差距较大。特别是超声提取物，生根中的总黄酮含量是蒲公英叶中含量的三倍。而生根回流提取物中的总黄酮含量相对于超声提取物有所减少，但仍高于叶，两者含量相差较小。对比蒲公英的熟根和生根提取物中总黄酮含量发现，生根中的总黄酮含量略高于熟根，原因可能是在生根炒制的过程中，由于温度较高，造成了黄酮类化合物的损失。

4 结语

本文以蒲公英提取物中总黄酮含量为指标，分别优化超声、回流提取长白山寒地蒲公英叶、生根和熟根实验条件，根据优化后的条件分别对不同的蒲公英部位进行提取，比较不同提取方法以及不同部位提取物中总黄酮含量的差异。结果表明，蒲公英生根中总黄酮含量最高，其次是熟根，叶中总黄酮含量相对最低；相对于回流提取，超声提取更有利于蒲公英中总黄酮提取率的提高，特别是对于蒲公英生根和熟根中总黄酮的提取效果较好，且超声提取具有省时高效、节能环保等优点。本研究为蒲公英的深加工和综合利用提供了探索及参考。