兰贵斌， 梁林慧， 余 飞， 黄承乐， 冯国钢， 黄敏玉

1.百色市人民医院 检验科，广西 百色 533000；2.右江民族医学院附属医院 泌尿外科，广西 百色 533000

世界范围内，不孕不育发生率在逐步升高[1-3]。有研究认为，50%及以上的不孕不育归因于男性，且与精子质量、数量等因素相关[4-5]。精子浓度、活性及形态等多项指标可评估男性精子质量[6]。2014年，《WHO人类精液检查及处理实验室检验手册(第5版)》发行增加了生化指标，如顶体酶活性，丰富了精子质量研究的内容[7]。但由于主客观因素，精子质量参数无法得到统一的参考指标，这为各参数标准的设置提供了挑战。有研究认为，DNA碎片指数(DNA fragmentation index，DFI)异常会影响男性正常生育能力，主要与精子、胚胎发育能力降低有关[8]。另有研究发现，DFI测量值与男性不孕不育存在一定的相关性，可作为男性生育的预测指标[9]。精子顶体酶是参与男性顶体反应的重要蛋白水解酶，其活性大小影响受精成功率，精子顶体酶活性降低会引起精子活性能力降低，精子畸形率升高[10-11]。然而，目前研究DFI、精子顶体酶活性与男性精子质量参数的内容较为单一，主要集中于浓度及形态学[12]，无法深层剖析DFI、精子顶体酶活性在男性生殖中的诊断价值。本研究旨在探讨DFI、精子顶体酶活性与精子质量参数间的相关性。现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集自2019年1月至2021年12月于百色市人民医院及右江民族医学院附属医院就诊的153例男性不育患者的精液样本。患者年龄22～43岁，平均年龄(33.70±7.87)岁；婚后2年及以上正常性生活无生育子女。纳入标准：(1)无外伤史；(2)无家族遗传病史；(3)无明显睾丸、输精管异常发育；(4)无生殖系统炎症。排除标准：(1)严重高血压、糖尿病史；(2)存在生育障碍史。

1.2 研究方法

1.2.1 样本采集 患者禁欲3～7 d后采用手淫方式获得精液，存于Eppendoorf管内，置于37℃水浴箱15～30 min或室温1 h至完全液化，未液化的可适当延长液化时间。

1.2.2 精子顶体酶活性测量 采用改良的Kennedy方法测量精子顶体酶活性，具体步骤：测定管和对照管均加入2×106～10×106个精子(少于250 μl)，常温条件下2 000 r/min离心20 min，弃管内精浆后加入100 μl A液吹打混匀；随后对照管加入100 μl C液；测定管和对照管均加入1 ml E液，24℃孵育1 h；测定管加入100 μl C液，常温条件下2 000 r/min离心15 min，取上清。在410 nm波长处用紫外分光光度计测量OD值。测量值≥48.2 μIU/106个精子为活性正常，测量值<48.2 μIU/106个精子为活性异常[13]。将患者分别纳入顶体酶活性正常组与顶体酶活性异常组。

1.2.3 精子DFI测量 采用吖啶橙染色法测量精子DFI。使用试剂A液稀释精子浓度至2×106～3×106个/ml，随后将样本加入至流式细胞仪小管中，加入试剂A液50 μl，轻轻混匀，然后加入试剂B液100 μl，轻轻混匀30 s，立即加入试剂C液300 μl，轻轻混匀，随后上流式细胞仪检测(488 nm激发光)。DFI<30%为检测正常，DFI≥30%为检测异常[14]。将患者分别纳入DFI正常组与DFI异常组。

1.2.4 精液质量参数分析 采用全自动精子分析仪测量精子总数、精子浓度、活动率、a+b级活动力等指标，采用Diff-Quik染色法进行精子形态学(畸形率)分析[15]。液化时间≤60 min为液化完全；活动率≥40%为正常；a+b级活动力≥50%为正常；精子畸形指数(TERATOZOOSPERMIA INDEX，TZI)正常范围为1～3。

2 结果

2.1 不同顶体酶活性患者精液质量参数比较 顶体酶活性正常组精子浓度、活动率、a+b级活动力均高于顶体酶活性异常组，TZI、液化时间低于顶体酶活性异常组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 不同顶体酶活性患者精液质量参数比较

2.2 不同DFI患者精液质量参数比较 DFI异常组精子浓度、活动率、a+b级活动力低于DFI正常组，TZI、液化时间高于DFI正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 不同DFI患者精液质量参数比较

2.3 相关性分析 Pearson线性相关结果显示，顶体酶活性与精子总数、精子浓度、a+b级活动力呈正相关(r=0.128、0.289、0.284，P<0.05)，与TZI、DFI呈负相关(r=-0.058、-0.248，P<0.05)；DFI与精子浓度、a+b级活动力、顶体酶活性呈负相关(r=-0.582、-0.374、-0.248，P<0.05)，与TZI呈正相关(r=0.128，P<0.05)。

3 讨论

男性不育主要与精液异常相关。常见的精液质量分析方法为显微镜观察，但由于存在主观因素误差，该方法观察各种指标无法统一量化[16]。因此，为男性精液质量评估寻找可靠的实验方法尤为重要。精子顶体酶是以酶原形式合成并储存的一种胰蛋白酶，主要位于精子顶部。顶体酶释放可为精卵结合提供有利条件，顶体酶活性降低会阻碍精子顺利穿透卵细胞透明带，引起男性不育[17-18]。本研究结果显示，顶体酶活性异常组精子浓度降低，与程玲等[19]研究结果相似，这可能与顶体酶活性改变DFI有关，畸形精子数量增加，可用于繁殖的精子浓度降低，从而降低生育概率[20]。

本研究发现，精子顶体酶活性异常者精子活动率及a+b级活动力明显降低，与刘洋[21]研究结果相似。但Raad等[22]研究认为，顶体酶活性仅与a+b级活动力相关，与本研究结果存在差异，可能与本研究纳入患者较少有关，需要进一步分析。a+b级活动力是指前进精子的总量，可用于判断精子的活性[23]。沈丽燕等[24]研究认为，顶体酶活性降低会影响精子穿透膜的能力，精子运动能力减弱，a+b级活动力也同步降低。本研究发现，DFI异常(即升高)可增加TZI，即增加精子畸形率，从而降低男性生育率，与朱元等[25]研究结果一致，分析原因为DFI异常使精子完整性降低，因此TZI增加；DFI异常者液化时间延长，与朱佳等[26]研究结果一致，这可能是DFI增加使精子完整性减弱，进而影响精囊分泌一系列生理因子，如凝固因子、纤维蛋白溶解酶等。值得注意的是，DFI异常虽会增加精子液化时间，但数值仍在正常参考范围内(≤60 min)，提示DFI延长精子液化时间可能非男性不育的重要原因。

相关性分析结果显示，顶体酶活性与精子浓度呈正相关，提示顶体酶活性会影响精子的生成状态。此外，本研究还发现，顶体酶活性与a+b级活动力呈正相关，表明顶体酶活性对于精子向前运动尤为重要。本研究对DFI与男性精子质量各参数进行相关性分析结果显示，DFI与精子浓度相关性最强(r=-0.582)，可能原因为DFI过高从而使精子结构异常，影响了其正常的存活率，精子浓度下降[27]。此外，本研究还发现，DFI与a+b级活动力呈负相关(r=-0.374)，且两者相关性强度大于顶体酶活性与a+b级活动力，提示DFI可能相较于顶体酶活性更能预测精子质量。值得注意的是，顶体酶活性与DFI也呈一定的负相关关系，提示DFI与顶体酶活性联合预测男性生殖能力可靠性更高。

综上所述，DFI、顶体酶活性可反映精子浓度、运动能力及完整性，两者可作为灵敏的生化指标预测男性不育，为男性生育能力研究提供理论依据。