谢丰璞，徐蓉蓉，高 静，关思静，葛甜甜，张亚丽，王 楠，颜永刚，李 铂，黄文静

（1陕西中医药大学陕西中药资源产业化省部共建协同创新中心，陕西咸阳 712083；2秦药特色资源研究开发国家重点实验室（培育），陕西咸阳 712083；3陕西中医药大学药学院，陕西咸阳 712046）

0 引言

种子的萌发需要良好的外界环境条件重新激活代谢活动，整个过程涉及呼吸过程、储备酶解、生物合成等一系列反应，使得种子达到发芽条件，直至长成幼苗[1]。种子萌发和幼苗生长都是植物发育的关键阶段，外界不利的生存环境可能使植物初期形态的建成受到影响，甚至影响植物的生长，从而导致植物无法成活。当下全球环境日益恶劣，土地问题甚多，植物的种子萌发与幼苗生长阶段受到了严重的影响。土地盐渍化和干旱问题一直以来是影响植物生长发育的重要难题。植物在胁迫下的生长发育备受关注，其研究内容涉及到旱、盐胁迫对植物种子萌发的影响[2]，旱、盐胁迫或者复合胁迫对植物生理生化特性的影响[3-4]，耐旱耐盐基因的发掘与应用及其植物新品种的理论研究[5-6]，植物抗逆育种中抗旱、耐盐相关基因的抗逆机制研究[7-9]，以及外源物质的添加是否对旱盐胁迫下种子萌发或幼苗生长具有缓解作用[10-11]等内容。

为了帮助植物更好地适应环境的变化，并保证资源的可持续性利用与发展，许多研究涉及在实验室模拟外界环境，通过添加外源物质来提高植物的耐旱、耐盐性等耐逆性，以期提高植物的抗性。所添加的外源物质种类涉及到激素类（赤霉素、脱落酸、吲哚乙酸等）[12]、吲哚类色胺（褪黑素）[13]、酚类化合物（水杨酸）等[10]。近年来，作为一种具有多种细胞活性和生理活性的多功能小分子褪黑素的研究逐渐增多。褪黑素不仅对非生物逆境具有一定的缓解作用，还可以调控生物逆境胁迫，比如低浓度的褪黑素可以抑制一些革兰式阳性及革兰氏阴性的病原菌[14]。《中国药典》中规定豆科植物扁茎黄芪(Astragalus complanatus)的干燥成熟种子为中药材沙苑子，其主要功效为补肾助阳固精缩尿、养肝明目，可用于治疗肾虚腰痛、遗精早泄、遗尿尿频、白浊带下等。当前恶劣的环境影响扁茎黄芪的产量。不同的温度、盐和干旱胁迫条件下褪黑素发挥的作用，以及扁茎黄芪的种子和幼苗在胁迫下如何响应褪黑素等问题尚不明确。本研究使用不同浓度的褪黑素溶液将扁茎黄芪浸种后，再以不同浓度的氯化钠(NaCl)、聚乙二醇6000(PEG)溶液模拟不同程度的盐胁迫和干旱胁迫条件，并将所有处理置于不同温度下探讨褪黑素对扁茎黄芪种子萌发与幼苗生长的影响，以期为提高其耐逆性提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验时间、地点

实验于2020年6—9月在陕西中医药大学陕西中药资源产业化省部共建协同创新中心实验室进行。

1.2 实验材料

实验选用的扁茎黄芪种子（沙苑子）购自陕西大荔，所用盐(NaCl)来自天津市天力化学试剂有限公司，次氯酸钠(NaClO)和聚乙二醇6000(PEG)来自天津市科密欧化学试剂有限公司，且均为分析纯。

1.3 实验设计

实验以扁茎黄芪的种子为研究对象，选择完好无损、颗粒饱满、完全成熟的种子，将种子用2%的NaClO消毒40 min后冲洗干净，备用。配制6个不同浓度的褪黑素(MT)溶液，浓度分别为0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6 mmol/L，用 T0～T5表示，体积为 50 mL。以NaCl溶液模拟盐环境，PEG溶液模拟干旱环境。配制3个不同浓度的PEG 6000溶液，浓度分别为15%、20%、25%，用P1、P2、P3表示；配制3个不同浓度的NaCl溶液，浓度分别为0.375%、0.635%、0.895%，用N1、N2、N3表示，且PEG和NaCl处理液渗透势分别为-0.3、-0.5、-0.7 MPa。分别置于4个温度(15、20、25、30℃)进行实验。以NaCl和PEG处理为实验组，蒸馏水处理为对照组(CK)。将选好的种子浸泡至不同浓度的褪黑素溶液中，静置24 h。将褪黑素浸泡过的种子置于铺有2层滤纸的培养皿中，每个培养皿中放30粒种子，相同的处理设置3次重复，在12 h/12 h的光/暗周期交替的人工气候箱中完成实验，观察种子的萌发情况。实验开始起每隔24 h对各培养皿进行观察，记录萌发种子数，补充相应处理液，并每隔2天更换处理液和滤纸。

1.4 种子萌发指标与幼苗生长指标的测定

连续记录13天后，培养皿中无种子发芽，停止观察。计算种子最终发芽率、平均发芽时间。

式中，nt为第t天的发芽数，n为最终发芽数。

第14天，从相同处理的培养皿中，选取6个发芽与长势良好的幼苗，用滤纸吸干幼苗上的水分，用刻度尺测定胚根、胚轴、子叶的长度，并将其放至烘箱，温度设置为80℃，烘4 h，称量干重。

1.5 数据处理

采用Microsoft Excel 2013软件和IBM SPSS Statistics 21统计分析软件对萌发和生长指标数据进行计算，并进行差异显著性分析（LSD法，P＜0.05）和多因素方差分析；Canoco软件进行t值双序图分析；使用Design Expert 8.0软件进行响应面分析与预测，并用SigmaPlot 14.0软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 褪黑素对盐胁迫和干旱胁迫下扁茎黄芪种子萌发的影响

盐胁迫下（表1），经不同浓度的褪黑素溶液处理后，扁茎黄芪种子在3个胁迫浓度间最终发芽率差异不明显。15℃时，N2T5最终发芽率最高(88.89%)，显著高于同组其他处理(P＜0.05)，而N3T5最低(56.67%)；20℃时，CK最终发芽率最高(86.67%)，显著高于同组其他处理(P＜0.05)，而N3T2最低(50%)；25℃时，N2T4最终发芽率(82.22%)显著高于同组其他处理(P＜0.05)，最低值出现在N3T5(52.69%)；30℃时，N1T3最终发芽率最高(81.11%)，而N3T5的最低(40%)。

表1 不同处理下褪黑素对扁茎黄芪种子最终发芽率的影响(±s，n=3)%

表1 不同处理下褪黑素对扁茎黄芪种子最终发芽率的影响(±s，n=3)%

胁迫类型 处理 15℃ 20℃ 25℃ 30℃空白对照盐胁迫CK N1T0 N1T1 N1T2 N1T3 N1T4 N1T5 N2T0 N2T1 N2T2 N2T3 N2T4 N2T5 N3T0 N3T1 N3T2 N3T3 N3T4 N3T5 84.44±11.71ab 65.55±6.94abc 81.11±3.85ab 62.22±8.39bc 73.33±3.33abc 81.11±8.39ab 83.33±5.77ab 76.67±12.02abc 84.44±6.94ab 76.67±6.67abc 82.22±5.09ab 73.33±3.33abc 88.89±3.85a 73.33±12.02abc 85.56±5.09ab 78.89±8.39abc 75.56±13.88abc 70.00±3.33abc 56.67±4.71c 86.67±3.33a 72.22±3.85abc 66.67±3.33abc 60.00±3.33bc 80.00±8.82ab 70.00±6.67abc 66.67±8.82abc 58.89±13.47bc 55.56±5.09bc 60.00±3.33bc 65.56±6.94abc 72.22±10.72abc 66.67±10abc 65.00±16.50abc 70.00±3.85abc 50.00±1.92c 70.00±7.70abc 65.00±6.94abc 58.33±15.03bc 63.33±6.67abc 81.11±1.92ab 72.22±3.85abc 65.56±4.71abc 81.11±8.39ab 76.67±6.67ab 62.22±7.07abc 60.00±8.82bc 68.89±5.09abc 62.22±5.09abc 66.67±4.71abc 82.22±1.92a 73.33±3.33abc 72.22±3.85abc 60.83±7.42abc 73.33±6.67abc 68.89±5.09abc 72.22±7.70abc 52.69±5.73c 63.33±10ab 65.56±1.92ab 70.00±8.82ab 75.56±10.72ab 81.11±9.62a 72.22±5.09ab 70.00±8.82ab 67.78±1.92ab 61.11±9.62ab 53.33±8.82ab 67.78±5.09ab 58.89±15.03ab 61.11±15.40ab 64.44±8.39ab 61.67±2.36ab 53.33±0.00b 46.67±0.00b 60.00±16.50ab 40.00±6.67b

续表1

干旱胁迫下（表1），随着温度的升高，扁茎黄芪最终发芽率整体降低。不同浓度的褪黑素溶液处理在一定程度上缓解了干旱胁迫造成的影响，同一温度下随着干旱程度的增加，扁茎黄芪种子最终发芽率降低。15℃时，CK的最终发芽率最高(84.44%)；20℃时，与CK组相比，P1胁迫下，T3处理的最终发芽率最高(88.89%)；25℃时，处理组P1T3发芽率最高，CK与胁迫P1的各处理间无显著性差异，当胁迫为P2和P3时，各处理组发芽率显著性降低(P＜0.05)，尤其是P3；30℃时，CK与处理组P1T0、P1T2和P1T4无显著性差异，但处理组P2T0、P2T2、P2T4和P2T5发芽率显著降低(P＜0.05)，随着胁迫程度的增加，部分处理组种子出现未发芽的情况，尤其是胁迫为P3时，各处理组均未发芽。

盐胁迫和干旱胁迫下，各温度平均发芽时间随着胁迫程度的增加不同程度增加（表2）。盐胁迫下，扁茎黄芪平均发芽时间在15～25℃时随着胁迫程度的增加而增加，但30℃时在3个胁迫间无显著差异。15℃时，N3T3的平均发芽时间（4.83天）显著大于其他处理组(P＜0.05)，而N1T2（1.90天）的显著小于其他处理组(P＜0.05)；20℃时，N3T0的平均发芽时间（4.66天）显著大于其他处理组(P＜0.05)，而CK组最小（1.88天）；25℃时，除N1T4的平均发芽时间（1.78天）显著小于其他处理组外，其余各处理均大于CK组（1.79天），最大值出现在处理组N3T5（5.22天）。30℃时，N3T0处理组发芽时间最长（2.82天），而N1T5处理组发芽时间最短（1.89天）。干旱胁迫下，扁茎黄芪在15、20、30℃时，P2和P3胁迫下平均发芽时间明显大于P1，且20～30℃时各处理组的平均发芽时间均大于CK组。15℃时，P3T4平均发芽时间最长（8天）；20℃时，P3T4发芽时间（8天）显著大于其他处理；25℃时，发芽时间在3个胁迫间差异不是很明显；30℃时，P2T0发芽时间（5.17天）显著大于其他处理(P＜0.05)。

表2 不同处理下扁茎黄芪种子平均发芽时间的变化(±s，n=3) d

表2 不同处理下扁茎黄芪种子平均发芽时间的变化(±s，n=3) d

胁迫类型 处理15℃20℃25℃30℃空白对照盐胁迫盐胁迫CK N1T0 N1T1 N1T2 N1T3 N1T4 N1T5 N2T0 N2T1 N2T2 N2T3 N2T4 N2T5 N3T0 N3T1 N3T2 N3T3 N3T4 N3T5 P1T0 P1T1 P1T2 P1T3 P1T4 P1T5 P2T0 P2T1 P2T2 P2T3 P2T4 P2T5 P3T0 P3T1 P3T2 P3T3 P3T4 P3T5 3.15±0.10bcd 2.24±0.13efg 2.27±0.14defg 1.90±0.34g 2.08±0.03fg 2.15±0.36efg 2.16±0.11efg 2.47±0.10cdefg 2.19±0.19efg 2.05±0.18fg 2.37±0.42defg 3.10±0.39bcde 2.60±0.31cdef 3.34±0.11bc 2.85±0.13cdef 3.23±0.09bcd 4.83±0.17a 3.53±0.47bc 4.25±0.12ab 3.00±0.27ab 2.86±0.14ab 3.10±0.34ab 3.22±0.18ab 3.19±0.40ab 3.35±0.12ab 6.16±0.28a 5.40±0.62a 5.58±0.00a 4.84±0.39ab 5.75±0.042a 5.10±0.27ab 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 5.00±0.00ab 8.00±0.00a 5.5±0.70ab 1.88±0.26d 2.35±0.25bcd 2.0±0.15cd 2.27±0.14bcd 1.89±0.04cd 2.41±0.21bcd 2.02±0.14cd 3.18±0.04ab 2.16±0.08bcd 2.67±0.17bcd 2.19±0.25bcd 2.34±0.09bcd 2.36±0.28bcd 4.66±0.17a 2.89±0.07ab 4.34±0.07a 2.89±0.14ab 3.17±0.15ab 2.98±0.03ab 2.94±0.49f 3.29±0.54ef 3.22±0.69ef 2.99±0.48f 2.63±0.29fg 2.17±0.19g 5.86±0.29b 4.67±0.12c 5.00±1.06bc 4.00±0.55d 3.84±0.15de 3.58±0.45e 5.50±0.35bc 6.50±0.70ab 6.00±0.00b 7.25±1.06ab 8.00±0.00a 6.20±0.00b 1.79±0.19g 2.24±0.44efg 2.26±0.08efg 1.93±0.38g 2.06±0.17fg 1.78±0.08g 2.51±0.58def 3.80±0.44abcd 3.25±0.56cdef 2.64±0.19def 3.26±0.25cdef 3.56±0.63cde 3.27±0.20cdef 4.34±0.34ab 4.17±0.29abc 3.76±0.50bcd 4.07±0.11abc 4.59±0.51ab 5.22±0.25a 2.86±0.50a 2.66±0.17ab 2.98±0.17a 2.70±0.31ab 3.41±0.20a 3.24±0.46a 3.00±0.24a 3.30±0.24a 2.33±0.24b 3.48±0.94a 3.66±0.48a 2.99±0.15a 2.00±0.14bc 0.00±0.00 4.00±0.11a 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 2.05±0.41a 2.00±0.09a 1.93±0.20a 2.06±0.14a 2.31±0.03a 2.27±0.09a 2.39±0.05a 2.26±0.10a 2.38±0.16a 2.24±0.08a 2.08±0.03a 2.25±0.41a 2.19±0.19a 2.52±0.08a 2.25±0.48a 2.53±0.75a 2.50±0.00a 2.38±0.50a 2.15±0.19a 2.68±0.14ab 2.66±0.01ab 2.63±0.09ab 2.75±0.11ab 2.46±0.24ab 2.67±0.30ab 5.17±1.18a 0.00±0.00 1.67±0.71ab 0.00±0.00 4.25±1.06ab 3.29±0.40ab 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00

2.2 不同温度下褪黑素对盐胁迫和干旱胁迫下对扁茎黄芪幼苗生长的影响

由表3可知，同一温度下，胚根长随着盐胁迫和干旱胁迫渗透势的增加而降低；同一渗透势胁迫下，胚根长随着温度的增加而先增加后减少；而胚根长随着温度和胁迫渗透势的变化而变化不同。盐胁迫下，温度为20℃和25℃时扁茎黄芪经褪黑素处理后幼苗胚根长势最好；胚根在经褪黑素处理后增加，其长度大于T0和CK纯水处理组，25℃时N1T3处理的胚根长达到最大值(5.07 cm)。干旱胁迫下，20℃时扁茎黄芪经褪黑素处理后幼苗胚根长势最好，而15℃和30℃时2种胁迫下扁茎黄芪胚根长势最差；25℃时，P1T2处理的胚根长达到最大值(7.07 cm)。

表3 不同处理下扁茎黄芪幼苗胚根的变化(±s，n=3) cm

表3 不同处理下扁茎黄芪幼苗胚根的变化(±s，n=3) cm

胁迫类型空白对照盐胁迫盐胁迫处理CK N1T0 N1T1 N1T2 N1T3 N1T4 N1T5 N2T0 N2T1 N2T2 N2T3 N2T4 N2T5 N3T0 N3T1 N3T2 N3T3 N3T4 N3T5 P1T0 P1T1 P1T2 P1T3 P1T4 P1T5 P2T0 P2T1 P2T2 P2T3 P2T4 P2T5 P3T0 P3T1 P3T2 P3T3 P3T4 P3T5 15℃0.82±0.27abcde 0.83±0.093bcde 1.62±0.13a 0.96±0.18bcde 0.83±0.13bcde 0.68±0.10de 0.46±0.13e 1.28±0.08abcd 1.47±0.17ab 0.95±0.21bcde 0.84±0.12bcde 0.54±0.25e 1.00±0.24abcde 0.82±0.13cde 0.78±0.14de 0.67±0.23de 0.41±0.12e 0.60±0.11e 0.73±0.17de 1.00±0.20bcd 1.23±0.21bc 1.45±0.18b 2.05±0.23a 1.18±0.17bcd 1.20±0.16bcd 0.66±0.16def 1.10±0.19bcd 0.79±0.20cdef 1.09±0.22bcd 0.34±0.06fg 0.47±0.13efg 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 20℃2.89±0.42bcd 4.40±0.1a 2.45±0.45bcde 2.97±0.42bcd 3.12±0.49bc 3.28±0.40ab 1.42±0.24efg 2.20±0.41cdef 1.83±0.43defg 2.95±0.37bcd 2.17±0.48cdef 2.77±0.15bcd 1.58±0.30efg 0.92±0.28g 1.50±0.32efg 1.33±0.10efg 1.40±0.20efg 1.37±0.38efg 1.12±0.20fg 6.42±0.15a 6.67±0.15a 5.27±0.15ab 6.65±0.05a 6.60±0.07a 3.82±0.1bc 3.07±0.14c 4.00±0.07bc 2.83±0.07c 3.12±0.14c 4.53±0.14bc 3.68±0.17bc 1.12±0.03d 1.00±0.00d 1.40±0.07d 0.13±0.05d 0.85±0.00d 1.02±0.00d 25℃1.56±0.25de 2.55±0.26d 4.53±0.24ab 4.18±0.25abc 5.07±0.11a 4.60±0.28ab 4.38±0.32abc 0.97±0.23ef 3.53±0.15c 1.9±0.27de 1.87±0.25de 3.87±0.29bc 1.72±0.20def 0.80±0.28f 0.98±0.19ef 1.22±0.27ef 1.183±0.36ef 1.25±0.23ef 1.35±0.12ef 2.32±0.20c 5.35±0.25ab 7.07±0.21a 4.88±0.21b 4.77±0.14b 4.37±0.17b 1.70±0.12cd 1.83±0.22cd 1.45±0.20cd 1.77±0.20cd 1.72±0.1cd 1.85±0.07cd 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 30℃0.66±0.13cd 2.03±0.21ab 2.72±0.17a 2.77±0.17a 1.83±0.12b 2±0.14ab 1.4±0.14bc 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 2.12±0.17a 1.32±0.12bc 1.38±0.18bc 1.02±0.11cd 1.57±0.17b 1.47±0.18b 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00

由表4可知，盐胁迫下，实验组胚轴长大于对照组，15～25℃时经不同浓度褪黑素处理后扁茎黄芪胚轴在3种胁迫下长势良好。N1和N2略优于N3，但褪黑素各浓度间在15～25℃范围内差异不明显，30℃时胚轴长度随着褪黑素浓度的增加而减少；15～30℃时各处理组胚轴长均大于纯水处理组；30℃的胚轴长在胁迫浓度为N1时整体趋势略大于其他温度。干旱胁迫下，胚轴在温度为15℃和30℃、胁迫浓度为P1时，各处理胚轴整体长势良好，而温度为20℃和25℃时，3个胁迫间差异不明显。盐胁迫下，30℃时N1T1处理的胚轴长出现最大值(1.42 cm)；干旱胁迫下，15℃时P1T3处理的胚轴长达到最大值(1.28 cm)。综合来看，扁茎黄芪幼苗胚轴在盐胁迫下的生长情况优于干旱胁迫。

表4 不同处理下扁茎黄芪幼苗胚轴的变化(±s，n=3) cm

表4 不同处理下扁茎黄芪幼苗胚轴的变化(±s，n=3) cm

胁迫类型空白对照盐胁迫盐胁迫处理CK N1T0 N1T1 N1T2 N1T3 N1T4 N1T5 N2T0 N2T1 N2T2 N2T3 N2T4 N2T5 N3T0 N3T1 N3T2 N3T3 N3T4 N3T5 P1T0 P1T1 P1T2 P1T3 P1T4 P1T5 P2T0 P2T1 P2T2 P2T3 P2T4 P2T5 P3T0 P3T1 P3T2 P3T3 P3T4 P3T5 15℃0.44±0.05abc 0.70±0.09a 0.63±0.11abc 0.68±0.08ab 0.62±0.15abc 0.47±0.12bc 0.55±0.08abc 0.71±0.13a 0.63±0.16abc 0.65±0.18abc 0.68±0.09ab 0.53±0.06abc 0.51±0.07abc 0.63±0.09abc 0.5±0.10abc 0.58±0.10abc 0.43±0.07c 0.54±0.05abc 0.55±0.08abc 1.10±0.12ab 1.15±0.12a 1.23±0.18a 1.28±0.11a 0.98±0.16abc 0.83±0.17bcd 0.34±0.06f 0.51±0.04ef 0.63±0.18def 0.78±0.1cde 0.56±0.08def 0.55±0.13def 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 20℃0.64±0.22d 0.78±0.09abcd 0.75±0.13abcd 0.88±0.09abc 0.97±0.10a 0.82±0.09abc 0.88±0.16abc 0.82±0.15abc 0.95±0.10ab 0.78±0.17abcd 0.8±0.14abc 0.77±0.08abcd 0.88±0.17abc 0.72±0.07bcd 0.75±0.08abcd 0.65±0.05cd 0.83±0.12abc 0.78±0.09abcd 0.71±0.04bcd 0.48±0.04abc 0.58±0.09ab 0.47±0.08abc 0.65±0.10a 0.48±0.09abc 0.58±0.09ab 0.43±0.08abc 0.47±0.08abc 0.38±0.07bcde 0.48±0.04abc 0.4±0.08abcd 0.47±0.10abc 0.30±0.10def 0.40±0.14ef 0.33±0.11def 0.27±0.05f 0.30±0.14ef 0.36±0.11cdef 25℃0.59±0.07d 0.85±0.05abcd 0.82±0.13abcd 0.75±0.10abcd 0.93±0.17abc 0.95±0.08ab 0.88±0.12abc 0.78±0.13abcd 0.95±0.18ab 0.82±0.18abcd 0.97±0.12a 1.02±0.09a 1.00±0.16a 0.60±0.08d 0.67±0.13cd 0.92±0.07abc 0.77±0.12abcd 0.68±0.13bcd 0.78±0.09abcd 0.45±0.08abcd 0.50±0.06abcd 0.52±0.04abc 0.57±0.07ab 0.55±0.04ab 0.53±0.05ab 0.39±0.08cd 0.42±0.07bcd 0.45±0.05bcd 0.52±0.04abc 0.48±0.07abc 0.35±0.05d 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 30℃0.52±0.08d 1.22±0.17ab 1.42±0.17a 1.07±0.18bc 0.93±0.15c 0.96±0.20c 0.81±0.17cd 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.97±0.15a 0.75±0.17cd 0.73±0.12cd 0.67±0.16cd 0.93±0.1bc 0.93±0.16ab 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00

由表5可知，各温度下经过褪黑素处理扁茎黄芪子叶在盐胁迫的生长情况优于干旱胁迫，且随着胁迫程度的增加，子叶长度减小。盐胁迫下，各处理组子叶长显著大于CK(P＜0.05)；15℃时，各处理的子叶长度较小；20℃时，N1T3子叶长达到最大值(0.95 cm)。干旱胁迫下，温度为15～25℃时，CK的子叶长显著大于各处理组(P＜0.05)，而温度升高到30℃时，子叶长度显著增加，处理组显著大于CK(P＜0.05)；P1的子叶长大于P2，显著大于P3(P＜0.05)。

表5 不同处理下扁茎黄芪幼苗子叶的变化(±s，n=3) cm

表5 不同处理下扁茎黄芪幼苗子叶的变化(±s，n=3) cm

胁迫类型空白对照盐胁迫盐胁迫处理CK N1T0 N1T1 N1T2 N1T3 N1T4 N1T5 N2T0 N2T1 N2T2 N2T3 N2T4 N2T5 N3T0 N3T1 N3T2 N3T3 N3T4 N3T5 P1T0 P1T1 P1T2 P1T3 P1T4 P1T5 P2T0 P2T1 P2T2 P2T3 P2T4 P2T5 P3T0 P3T1 P3T2 P3T3 P3T4 P3T5 15℃0.44±0.01b 0.60±0.08ab 0.64±0.07a 0.49±0.09ab 0.57±0.07ab 0.41±0.08b 0.57±0.06ab 0.64±0.05a 0.65±0.06a 0.56±0.10ab 0.60±0.06a 0.51±0.08ab 0.55±0.10ab 0.58±0.08ab 0.58±0.09ab 0.51±0.03ab 0.41±0.08b 0.50±0.06ab 0.47±0.09ab 0.31±0.01cdef 0.38±0.09bc 0.36±0.04bcde 0.39±0.04ab 0.36±0.047bcd 0.32±0.04cdef 0.29±0.05def 0.25±0.03f 0.30±0.06cdef 0.28±0.02def 0.27±0.04f 0.28±0.04ef 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 20℃0.55±0.02f 0.88±0.11abc 0.77±0.10bcd 0.90±0.00ab 0.95±0.12a 0.87±0.12abc 0.68±0.08def 0.85±0.05abc 0.87±0.08abc 0.83±0.10bcde 0.87±0.05abc 0.82±0.04bcde 0.85±0.08abc 0.70±0.089def 0.73±0.05cde 0.70±0.08def 0.72±0.07def 0.70±0.08def 0.65±0.12ef 0.48±0.04ab 0.50±0.00ab 0.40±0.06bc 0.47±0.08abc 0.47±0.05abc 0.42±0.04bc 0.30±0.08cd 0.42±0.07bc 0.30±0.06cd 0.33±0.05bcd 0.35±0.05bcd 0.37±0.05bcd 0.23±0.05e 0.25±0.07e 0.20±0.00e 0.20±0.00e 0.25±0.07e 0.24±0.05e 25℃0.44±0.10ef 0.72±0.09abc 0.88±0.08a 0.68±0.07bcd 0.70±0.089bcd 0.68±0.09bcd 0.73±0.08ab 0.58±0.04cdef 0.65±0.08bcde 0.62±0.04bcde 0.65±0.05bcde 0.67±0.08bcde 0.58±0.04cdef 0.42±0.09f 0.53±0.05def 0.57±0.05def 0.53±0.05def 0.55±0.08cdef 0.57±0.08cdef 0.36±0.08bcd 0.43±0.08abc 0.43±0.04abc 0.43±0.08abc 0.52±0.04a 0.44±0.04ab 0.26±0.04d 0.3±0.06cd 0.3±0.05cd 0.25±0.05d 0.25±0.08d 0.25±0.08d 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 30℃0.16±0.01c 0.70±0.12a 0.72±0.11a 0.72±0.11a 0.63±0.1ab 0.74±0.05a 0.48±0.09b 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.68±0.11a 0.5±0.10b 0.55±0.10ab 0.48±0.07b 0.550±.11ab 0.55±0.10ab 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00

从表6可以看出，不同的温度、NaCl、PEG胁迫和褪黑素浓度对扁茎黄芪的种子萌发和幼苗生长具有不同程度的影响。盐胁迫下，温度、NaCl胁迫渗透势和褪黑素浓度对扁茎黄芪的最终发芽率、平均发芽时间、胚根长和子叶长有显著影响(P＜0.05)；干旱胁迫下，温度和PEG胁迫渗透势对扁茎黄芪的平均发芽时间、胚根长、胚轴长和子叶长有极显著影响(P＜0.01)，而褪黑素浓度对最终发芽率和胚根长有极显著影响(P＜0.01)。综上可知，相同温度下，扁茎黄芪经褪黑素处理后，其耐盐性大于耐旱性，且随着胁迫程度的增加，其生长受到抑制，尤其是30℃下胁迫-0.7 MPa，扁茎黄芪的种子萌发和幼苗生长严重受到影响，盐胁迫下种子萌发后的生长受到抑制，而干旱胁迫下种子出现未发芽的情况。

表6 在不同温度、NaCl和PEG胁迫下褪黑素对扁茎黄芪生长发育的多因素方差分析（F值）

2.3 不同温度下褪黑素对盐胁迫和干旱胁迫下对扁茎黄芪幼苗生长的影响评价

2.3.1t值双序图分析 为确定温度、胁迫、褪黑素对扁茎黄芪种子和幼苗指标的具体影响，进一步采用t值双序图进行分析（图1）。NaCl胁迫下，扁茎黄芪萌发的各项指标都没有落入褪黑素浓度(MT)的白色或者黑色圆圈内。其中，总干重(TDW)和子叶长(CL)靠近MT的黑色圆圈，说明它们与MT浓度呈负相关关系，表明褪黑素浓度的增加将导致这些指标一定程度的下降。但MT与总干重和子叶长并没有完全落入黑色圆圈内，说明它们之间的负相关关系没有达到显著水平（图1A）。NaCl胁迫下，外界温度(T)与最终发芽率(TGP)、胚轴长(HL)、子叶长、总干重成显著负相关关系（图1B）。PEG胁迫下，TGP完全落入MT的白色圆圈内，而CL、HL、RL、TDW、MGT靠近MT的白色圆圈，说明MT与最终发芽率呈显著正相关关系，与子叶长、胚轴长、胚根长、总干重和平均发芽时间呈正相关关系（图1C）。PEG胁迫下，外界温度(T)与最终发芽率、平均发芽时间、胚轴长、子叶长、总干重呈显著负相关关系，与胚根长呈负相关关系（图1D）。通过以上分析可以看出，外界温度是盐和干旱胁迫下扁茎黄芪种子萌发与幼苗生长的关键因子，而褪黑素一定程度上可以缓解盐和干旱胁迫对扁茎黄芪造成的影响。

图1 PEG和NaCl胁迫下褪黑素对扁茎黄芪种子和幼苗特征影响的检验结果

2.3.2 响应面分析 利用Design Expert软件，以不同实验温度、NaCl和PEG胁迫、褪黑素浓度为考察因素，萌发指标（最终发芽率和平均发芽时间）和幼苗生长指标（胚根长、胚轴长、子叶长和总干重）为响应值，预测温度、胁迫和褪黑素处理的最佳组合。由图2可知，随着温度的增加，扁茎黄芪种子的最终发芽率、平均发芽时间增加，胚根长、胚轴长、子叶长和总干重先增加后减少；随着NaCl胁迫渗透势的升高，最终发芽率、胚根长、胚轴长、子叶长和总干重减少，而平均发芽时间增加；随着褪黑素浓度的增加，最终发芽率、平均发芽时间、胚根长、胚轴长、子叶长和总干重先增后减。由图3可知，PEG胁迫下，最终发芽率随温度的增加而减少、随胁迫渗透势升高而降低，平均发芽时间随着温度的增加、PEG胁迫渗透势的升高和褪黑素浓度的增加而增加，胚根长、子叶长、总干重随着温度的增加而先升高后降低，胚轴长随着温度的升高而降低。随着PEG胁迫渗透势的增加，最终发芽率、胚根长、胚轴长、子叶长和总干重均减小。NaCl胁迫下最终发芽率、胚根长、胚轴长、子叶长、总干重在20～25℃内达到最大值，平均发芽时间在15～20℃时最短；PEG胁迫下最终发芽率、胚轴长、子叶长在15～20℃内达到最大值，胚根长、总干重在20～25℃内达到最大值，平均发芽时间在25～30℃时最短。由软件综合预测，使扁茎黄芪萌发和生长的最佳组合分别为：NaCl处理时，温度24.72℃、NaCl渗透势-0.36 MPa、褪黑素浓度0.41 mmol/L；PEG处理时，温度18.38℃、PEG渗透势-0.21 MPa、褪黑素浓度0.28 mmol/L。

图2 不同温度、NaCl胁迫、褪黑素浓度对扁茎黄芪生长影响的响应面

图3 不同温度、PEG胁迫、褪黑素浓度对扁茎黄芪生长影响的响应面

3 结论与讨论

种子发芽和早期幼苗生长被认为是植物形态建成和生长最关键的阶段。当生物体因干旱、低温、高温、盐渍等多种逆境形成水分胁迫，渗透调节作用是植物适应外界胁迫的重要生理机制之一。植物体内可主动积累各种渗透调节物质来提高细胞液浓度，降低渗透势，提高细胞吸水或保水能力，从而适应胁迫环境[15]。植物长期处于盐胁迫条件，可导致其体内离子平衡失调、有毒物质积累，最后会影响植物的生长发育。胁迫条件下植物的发芽率及外部形态是受胁迫影响的直接表现，胁迫越大出苗率越低，从而影响后期发育以及产量[16]。本研究发现，褪黑素可以明显改善盐胁迫对扁茎黄芪造成的伤害，促进其种子萌发与生长，所有处理组的种子均发芽且长势良好，只有在高温(30℃)时，发芽后期种子长势较缓，无法进行测量。而干旱胁迫下，低温(15～25℃)时褪黑素促进了扁茎黄芪的种子萌发与幼苗生长，在高温时某些处理组种子未发芽。由此说明，扁茎黄芪对温度较为敏感，经褪黑素处理后在15～25℃时长势优于30℃。温度是种子萌发的重要因子，种子萌发时的物质和能量转化需要酶的催化，而酶在一定的温度范围内保持其活性，当温度升高时酶活性可能失活，无法发挥其作用[17]。此外，相同温度下，扁茎黄芪经褪黑素处理后，随着胁迫程度的增加，其生长仍然受到抑制，尤其是当干旱渗透势达到-0.7 MPa时，由于为重度胁迫，部分处理组种子未发芽。这说明扁茎黄芪耐盐性大于耐旱性，分析其原因可能是实验中使用PEG溶液来模拟干旱环境，PEG为乙醇聚合物，分子量高，无法通过植物细胞壁进入细胞，可用于调节植物所处环境的水分渗透压[18]。而干旱则会使种子吸水速率减慢，最大吸水量减小，随着干旱程度的增加，种子萌发受到抑制或发芽延迟的程度亦会随之增加。所以即使经褪黑素处理后，扁茎黄芪种子仍会出现未萌发的现象。这说明干旱胁迫对植物生理反应的影响取决于干旱水平和植物的生长阶段，干旱程度越高，植物种子和幼苗的耐受性较低。

盐渍、干旱、高温、低温等胁迫均属于非生物胁迫，它们通过不同的方式影响植物的生长发育，导致植物生长的某一阶段受到限制，最终影响到植物生物量的形成。研究表明，外源添加褪黑素可增强某些植物物种的非生物胁迫耐受性。褪黑素处理可提高大豆对盐胁迫及干旱胁迫的耐受力[19]。在低温和干早胁迫下，褪黑素能够缓解黑麦草的生长抑制，增强其抗寒和抗旱性[20]。本研究中，扁茎黄芪经褪黑素浸种后，其萌发与生长在外界胁迫条件下得到了一定的改善。同样的，在干旱和盐胁迫条件下褪黑素处理黄瓜种子，能够提高黄瓜萌发率，并能够缓解干旱对黄瓜幼苗生长的抑制作用[21-22]。这可能是因为褪黑素是一种多功能抗氧化剂、一种无受体的有害自由基清除剂，还作为酶促抗氧化防御系统的刺激物，可保护植物免受氧化损伤[23]。它能够清除活性氧(ROS)、活性氮(RNS)，可缓解植物对干旱、高温、高盐等胁迫的耐受性[24-25]。

本研究在4个不同温度、3个NaCl胁迫渗透势和3个PEG胁迫渗透势、6个褪黑素浓度的条件下进行，通过实验结果，结合t值双序图与响应面分析得出，低温低盐胁迫(15～25℃，-0.3、-0.5 MPa)的条件下，褪黑素促进了扁茎黄芪种子萌发和幼苗生长，而在高温高盐胁迫(30℃，-0.7 MPa)时，种子发芽后生长受限制；低温低干旱胁迫条件下，褪黑素促进了扁茎黄芪的种子萌发与幼苗生长，而在高温高干旱时某些处理组种子未发芽。由此可以看出，扁茎黄芪耐低温不耐高温，且耐盐性强于耐旱性。随着温度和胁迫程度的升高，褪黑素的缓解作用也受到抑制。但是，对于褪黑素在温度、盐胁迫和干旱胁迫等几个因子组成的复杂环境条件下的响应机制还有待进一步研究。