张玉华，孟 一，朱金峰，孙 毅，孙崇德

（1.国家农产品现代物流工程技术研究中心，山东济南 250103；2.山东商业职业技术学院山东省农产品贮运保鲜技术重点实验室，山东济南 250103；3.浙江大学园艺产品冷链物流工艺与装备国家地方联合工程实验室，浙江杭州 310058）

新鲜果蔬经切分后汁液流出，为微生物的繁殖提供营养，同时切割使组织裸露增加了微生物的侵染机会，致使其品质下降，货架期缩短，并且可能引起食源性疾病，对公众健康构成风险。因此如何抑制微生物的生长，是延长鲜切果蔬货架期，保证其食用安全性的关键。清洗处理是控制微生物滋生的有效手段，超声波用于鲜切果蔬的清洗杀菌，是利用低频高能量超声波的空化效应在液体中产生瞬间高温高压和强大的冲击波，导致微生物细胞壁、细胞膜和DNA遭到破坏，从而达到杀灭微生物的目的。超声波因其环保、无残留、安全和简便高效等性能被广泛用于果蔬贮藏保鲜，已在鲜切黄瓜、生菜和百合鳞片、胡萝卜、红薯、白菜、莲藕等鲜切果蔬的微生物控制方面取得良好的效果。超声波是一种辅助杀菌方法，将其与化学或生物杀菌剂结合，杀菌效果更好。针对不同鲜切果蔬原料的特点，选择合适的复合清洗技术和清洗条件十分必要。

-聚赖氨酸盐酸盐是一种天然生物抑菌剂，具有安全性高、热稳定性强以及抑菌谱广等优点，已被美国、日本、韩国和中国批准使用，对微生物具有广谱的抗菌性包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、酵母和霉菌等，已研究用于鲜切苹果、马铃薯、茄子、菠菜保鲜。将超声波与-聚赖氨酸盐酸盐结合用于鲜切苹果清洗处理的研究尚未见报道。

本研究将一定浓度的-聚赖氨酸盐酸盐溶液作为清洗液，与超声波结合用于处理鲜切苹果，以贮藏期内菌落增长数为响应值，通过响应面法对超声--聚赖氨酸盐酸盐复合处理条件进行优化。利用优化条件处理的鲜切苹果在4 ℃贮藏期间，根据其菌落总数、霉菌和酵母、色差和V的变化，系统分析超声--聚赖氨酸盐酸盐复合处理对鲜切苹果的保鲜作用，以期为鲜切苹果清洗技术研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

富士苹果 购于山东省烟台市，于0～1 ℃下预冷，选取大小、成熟度一致，无腐烂、挤压伤和病虫害的苹果备用；-聚赖氨酸盐酸盐 上海原叶生物科技有限公司；2,6-二氯靛酚钠、草酸、碳酸氢钠 国药集团化学试剂有限公司；保鲜膜为厚度为0.1 mm PE膜；保鲜盒为PP 材料。

F-060SD 超声波清洗器 深圳福洋科技集团有限公司；CR-400 色差计 杭州柯盛行仪器有限公司；Scientz-04z 均质器 宁波新芝生物科技股份有限公司；DL-CJ-2N 型超净工作台 北京东联哈尔仪器制造有限公司；YXQ-LS-30S11 高压灭菌锅 上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.2 实验方法

1.2.1 原料处理 切分前超声--聚赖氨酸盐酸盐复合处理：新鲜苹果→挑选→冲洗→超声（超声频率40 kHz，功率480 W）--聚赖氨酸盐酸盐室温下清洗→去皮、切分（四等分切块）→2.0 g/L L-半胱氨酸护色液浸泡5 min→沥干→放入保鲜盒中，保鲜膜封口→4 ℃贮藏。

切分后超声--聚赖氨酸盐酸盐复合处理：新鲜苹果→挑选→冲洗→去皮、切分（四等分切块）→超声（超声频率40 kHz，功率480 W）--聚赖氨酸盐酸盐室温下清洗→2.0 g/L L-半胱氨酸护色液浸泡5 min→沥干→放入保鲜盒中，保鲜膜封口→4 ℃贮藏。

超声时间的选择：在20 ℃下，分别超声5、10、15、20、25 min，-聚赖氨酸盐酸盐浓度为0.3 g/L。

超声温度的选择：分别在20、25、30、40、50 ℃下，超声10 min，-聚赖氨酸盐酸盐浓度为0.3 g/L。

-聚赖氨酸盐酸盐浓度的选择：分别利用0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 g/L-聚赖氨酸盐酸盐，在20 ℃下超声10 min。

1.2.3 响应面优化试验设计 在单因素实验基础上，进一步采用Box-Behnken 模型设计试验，以超声温度（A）、超声时间（B）和-聚赖氨酸盐酸盐浓（C）三个影响因素为自变量，以4 ℃贮藏期间第12 d 与第0 d 相比增加的菌落总数为响应值Y（其中切分前处理对应的菌落增长数为Y，切分后处理对应的菌落增长数为Y）。Box-Behnken 试验因素与水平见表1。

表1 Box-Behnken 试验因素与水平Table 1 Box-Behnken experimental factors and levels

1.2.4 超声--聚赖氨酸盐酸盐复合处理鲜切苹果贮藏试验 利用响应面优化的超声--聚赖氨酸盐酸盐复合处理方法，分别于切分前、切分后处理苹果，以未处理组为对照。将鲜切果蔬置于保鲜盒内，用保鲜膜封口，于4 ℃下贮藏，每2 d 取样分别检测菌落总数、霉菌和酵母、色差和V含量。

1.2.5 鲜切苹果品质指标的测定

1.2.5.1 菌落总数的测定 参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》规定的方法测定。取10 g 样品，置于无菌均质袋中，加入90 mL 无菌水，用拍打式均质器拍打1～2 min，制成1:10 样品匀液。再进一步稀释，选择3 个适宜稀释度的样品匀液，取1.0 mL 稀释液于灭菌凝固的培养基中，将菌悬液涂布均匀，每个稀释度做3 个平行，36±1 ℃培养24 h 后计数。

1.2.5.2 霉菌和酵母的测定 参照GB 4789.15—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》中霉菌和酵母的平板计数法测定。操作方法同菌落总数测定，采用马铃薯葡萄糖培养基，28±1 ℃培养48 h 后计数。

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1.2.5.3 色差的测定 按照Zhang 等的方法测定，色差的变化由、、值的变化来表示，3 个参数分别表示亮暗程度、红色度、黄色度。最终色差值由总色差△来表示，以标志白板进行色差计调零。记录、、值，并计算△值，△=[（△）+（△）+（△）]

1.2.5.4 V的测定 参照GB 5009.86—2016《食品安全国家标准 食品中抗坏血酸的测定》中2,6-二氯靛酚滴定法测定。

1.3 数据处理

采用Design-ExpertV8.0.6 进行响应面结果分析，采用OriginPro8.5 软件绘图，采用SPSS Statistics 20.0 软件对数据进行统计学分析，采用Duncan 多重比较法进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 超声时间对鲜切苹果微生物的影响 以各实验组第12 d 与第0 d 相比增加的菌落总数、霉菌和酵母数量为纵坐标，超声时间为横坐标绘图，分别见图1、图2。随超声时间延长，菌落总数、霉菌和酵母数量增加值呈先低后高的变化趋势，超声10 min 组最低，超声25 min 组最高，说明超声时间并非越长越好，长时间超声处理对苹果的组织结构产生机械性破坏，使其更容易染菌。切分后超声--聚赖氨酸盐酸盐复合处理组贮藏期间菌落总数、霉菌和酵母增加值高于对应的切分前处理组，可能是由于去皮、切分后苹果组织与外界环境接触，微生物侵染几率增加。最佳超声时间的考察范围为5～15 min。

图1 超声时间对菌落总数增长的影响Fig.1 Effect of ultrasonic time on the growth of the total number of colonies

图2 超声时间对霉菌和酵母数量增长的影响Fig.2 The effect of ultrasound time on the growth of mold and yeast populations

2.1.2 超声温度对鲜切苹果微生物的影响 超声波的杀菌效果与介质温度有关，一般来说温度越高，杀菌效果越好，但高温易破坏鲜切果蔬品质。由图3、图4 可见，鲜切苹果菌落总数、霉菌和酵母的增加值均随超声温度升高而降低，40 ℃与50 ℃两组无显著差异（＞0.05）。与超声时间对微生物增长的影响相似，切分前超声处理组菌落总数、霉菌和酵母增加值低于对应的切分后超声处理组。因此，选择30、40和50 ℃作为因素水平进行响应面优化试验。

图3 超声温度对菌落总数增长的影响Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the growth of the total number of colonies

图4 超声温度对霉菌和酵母数量增长的影响Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on the growth of mold and yeast populations

2.1.3-聚赖氨酸盐酸盐浓度对鲜切苹果微生物的影响 不同浓度-聚赖氨酸盐酸盐对鲜切苹果4 ℃贮藏0～12 d 期间菌落总数、霉菌和酵母数量增长的影响分别见图5、图6。将-聚赖氨酸盐酸盐作为超声液使用，其浓度越高抑菌效果越好，当浓度增加至0.2 g/L 时，进一步增加，即0.3 g/L 与0.4 g/L 两组差异不显著（＞0.05）。这与范凯研究结果类似，范凯研究了超声波与-聚赖氨酸联合气调对鲜切生菜冷藏期间品质的影响，发现随着-聚赖氨酸浓度增加，抑制微生物效果增加，当-聚赖氨酸浓度从0.4增至0.5 g/L 时，-聚赖氨酸对鲜切生菜贮藏过程中菌落总数、霉菌与酵母菌数量无显著性差异。因此，选择0.1、0.2 和0.3 g/L 作为响应面试验的三个水平。

图5 ε-聚赖氨酸盐酸盐浓度对菌落总数增长的影响Fig.5 Effect of ε-polylysine hydrochloride concentration on the growth of the total number of colonies

图6 ε-聚赖氨酸盐酸盐浓度对霉菌和酵母数量增长的影响Fig.6 Effect of ε-polylysine hydrochloride concentration on the growth of mold and yeast populations

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面试验设计与结果 采用Design-Expert 8.0.6 软件对试验结果（表2）进行回归分析，并进行二项式拟合和多元线性回归法处理，得到切分前、切分后超声--聚赖氨酸盐酸盐复合处理鲜切苹果各考察因素的一次效应、二次效应及其交互效应的实际因素关联方程分别如下：

表2 Box-Behnken 试验结果Table 2 Results of Box-Behnken experiment

2.2.2 回归方程方差分析 为验证方程的有效性，对上述回归方程进行方差分析，结果见表3、表4。切分前、后超声--聚赖氨酸盐酸盐复合处理两个模型均极显著（＜0.01），失拟项不显著（＞0.05），表明两模型均具有较高可靠性。调整决定系数分别为0.9637、0.9798，表明鲜切苹果菌落总数的变化源于超声时间、超声温度和-聚赖氨酸盐酸盐浓度的可能性分别为96.37%、97.98%。根据一次项的值，可知各试验因素对响应值菌落总数增长的影响的主次顺序为：C＞A＞B，即-聚赖氨酸盐酸盐浓度＞超声时间＞超声温度。其中，切分前超声--聚赖氨酸盐酸盐复合处理组一次项A 和C 对结果影响显著（＜0.05）；切分后超声--聚赖氨酸盐酸盐复合处理组一次项A 和C 对结果影响为极显著（＜0.01），超声温度对结果均无显著影响（＞0.05）。交互项中AB 项对结果影响不显著（＞0.05），AC 和BC 项对结果影响显著（＜0.05），表明A、B 无交互作用，A、C 和B、C 间有交互作用；二次项A、B和C对结果影响极显著（＜0.01）。综上说明，试验设计是可靠的，并且可以用来预测各种因素对菌落总数增长的影响。

表3 切分前超声-ε-聚赖氨酸盐酸盐复合处理组回归模型的方差分析Table 3 The variance analysis of regression model of ultrasonicε-polylysine hydrochloride compound treatment group before cutting

表4 切分后超声-ε-聚赖氨酸盐酸盐复合处理组回归模型的方差分析Table 4 The variance analysis of regression model of ultrasonicε-polylysine hydrochloride compound treatment group after cutting

2.2.3 响应面分析 图7 为超声时间、超声温度和-聚赖氨酸盐酸盐浓度各因素交互作用对鲜切苹果菌落总数增长影响的响应面3D 图。在固定其它因素的情况下，随着所考察因素值的升高，菌落总数均降低，在响应曲面的最低点（等高线的中心点）达到最小值后，菌落总数又呈现上升趋势。等高线的形状可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用较强，圆形表示交互作用较弱。图中a、a的等高线接近圆形，b、b、c、c的等高线均为椭圆形，说明A、B 间交互作用不显著，A、C 与B、C 间交互作用显著，与方差分析结果一致。

图7 超声时间、超声温度和ε-聚赖氨酸盐酸盐浓度的交互作用对菌落总数增长影响的响应面3D 图Fig.7 Response surface 3D diagram of the interaction of ultrasound time,ultrasound temperature and ε-polylysine hydrochloride concentration on the growth of the total number of colonies

2.2.4 验证试验 根据Design-Expert8.0.6 软件分析和数据优化，得到切分前超声--聚赖氨酸盐酸盐复合处理最优条件为超声时间为9.56 min、超声温度为40.63 ℃、-聚赖氨酸盐酸盐浓度为0.21 g/L，方程预测值为1.53 lg CFU/g。切分后超声--聚赖氨酸盐酸盐复合处理最优条件为超声时间为9.55 min、超声温度为40.63 ℃、-聚赖氨酸盐酸盐浓度为0.21 g/L，方程预测值为1.62 lg CFU/g。根据实际可操作性，将切分前与切分后超声--聚赖氨酸盐酸盐复合处理条件修正为超声时间为10 min、超声温度为40 ℃、-聚赖氨酸盐酸盐浓度为0.2 g/L。利用该优化参数处理鲜切苹果，在4 ℃下贮藏，切分前、后超声--聚赖氨酸盐酸盐复合处理组第12 d 比0 d 增加的菌落总数实际测定平均值分别为1.59 lg CFU/g、1.71 lg CFU/g，预测值与实测值相对误差分别为3.92%、5.59%，误差较小，说明响应面法建立的两个模型是可靠的。

2.3 超声-ε-聚赖氨酸盐酸盐复合处理对鲜切苹果贮藏品质的影响

2.3.1 超声--聚赖氨酸盐酸盐复合处理对鲜切苹果贮藏期间微生物的影响 利用响应面优化的参数处理鲜切苹果，在4 ℃贮藏过程中，菌落总数、霉菌和酵母数量变化情况如图8、图9 所示。对照组微生物数量增长速度最快，至第8 d 时，菌落总数4.48 lg CFU/g、霉菌和酵母3.95 lg CFU/g，结合感官分析判断接近货架期终点，超声--聚赖氨酸盐酸盐复合处理组上升速度显著低于对照（＜0.05），其中切分前处理组第12 d 时接近货架期终点，切分后处理组第10 d 时基本无食用价值。因此，从微生物角度判断，切分前超声--聚赖氨酸盐酸盐复合处理鲜切苹果可延长货架期4 d，切分后处理可延长货架期2 d。

图8 鲜切苹果贮藏期间菌落总数变化Fig.8 Changes of total colony number of fresh-cut apples during storage

图9 鲜切苹果贮藏期间霉菌和酵母变化Fig.9 Mold and yeast changes of fresh-cut apples during storage

2.3.2 超声--聚赖氨酸盐酸盐复合处理对鲜切苹果贮藏期间色差的影响 近年来，超声波在果蔬防褐变研究中得到了较好的应用。研究证明，在适当的条件下，超声处理能延缓鲜切果蔬的酶促褐变，原因是通过超声波空化作用、热效应和机械作用抑制与果蔬褐变相关的多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、过氧化物酶（peroxidase，POD）等的活性。贾玉等利用超声波辅助异抗坏血酸处理鲜切苹果，处理组的△值、PPO 活性及POD 活性均低于对照组。Fan 等研究发现，超声波联合-聚赖氨酸处理降低了鲜切莴苣的失重和总色差，降低了POD和PPO 活性。△表示总色差，其值越小，褐变程度越低。鲜切苹果在4 ℃贮藏过程中，△变化如图10所示，呈上升趋势。其中，切分前超声--聚赖氨酸盐酸盐复合处理组色差上升速度显著最慢（＜0.05），对照组与切分后超声--聚赖氨酸盐酸盐复合处理组无显著差异（＞0.05），可能是由于超声时间过长或强度过高造成切分后的苹果组织结构破坏，细胞膜通透性增加，导致酚类物质与酚类氧化酶接触，加速褐变。

图10 鲜切苹果贮藏期间色差值的变化Fig.10 Color difference changes of fresh-cut apples during storage

2.3.3 超声--聚赖氨酸盐酸盐复合处理对鲜切苹果贮藏期间V含量的影响 经超声--聚赖氨酸盐酸盐复合处理的鲜切苹果在4 ℃贮藏期间V含量变化如图11 所示，随贮藏时间延长，各处理组V含量逐步下降，贮藏12 d 内，切分前、切分后超声--聚赖氨酸盐酸盐复合处理组与对照组V含量下降值分别为27.42%、29.03%和29.92%，均无显著差异（＞0.05），说明超声处理产生的空化作用、热效应和机械作用并未对鲜切苹果的V产生破坏作用。

图11 鲜切苹果贮藏期间VC 含量的变化Fig.11 VC content changes of fresh-cut apples during storage

3 结论

采用Box-Behnken 设计响应面法分别建立了苹果切分前、切分后超声时间、超声温度、-聚赖氨酸盐酸盐浓度与0～12 d 内菌落增长数之间的响应面数学模型，确定了超声--聚赖氨酸盐酸盐复合处理鲜切苹果的最佳工艺参数为超声时间10 min、超声温度40 ℃、-聚赖氨酸盐酸盐浓度0.2 g/L，切分前与切分后处理菌落总数增加的实测值分别为1.59 lg CFU/g、1.71 lg CFU/g，与预测值相对误差分别为3.92%、5.59%，表明采用Box-Behnken 法优化鲜切苹果超声--聚赖氨酸盐酸盐复合处理方法可行、可靠。在此最优条件下处理的苹果4 ℃贮藏期间，细菌、霉菌和酵母在一定程度上受到抑制，褐变减缓，且该处理方式对鲜切苹果的V无明显破坏作用，其中切分前超声--聚赖氨酸盐酸盐复合处理对鲜切苹果保鲜效果较好，其货架期比对照组延长4 d。本研究为鲜切苹果清洗技术提供了一定的理论依据，对促进鲜切果蔬产业发展具有重要意义。