李 青， 葛传龙， 欧阳力剑， 金志梅， 杨 钦

(1.贵州省典型高原湿地生态保护与修复重点实验室，贵州毕节 551700； 2.贵州工程应用技术学院生态工程学院，贵州毕节 551700)

云贵高原位于我国西南部，是我国四大高原之一，海拔在400～3 500 m间。贵州草海国家级自然保护区位于云贵高原中部顶端，是一个典型的高原湿地生态系统。鲫鱼不仅是我国重要的淡水养殖经济鱼类，而且由于其多生活于水域的中下层，具有极强的低氧耐受性，是公认的低氧耐受力极强的鱼类之一。作为草海的优势鱼种，鲫鱼在长期高原低氧环境中，进化出特有的身体机能以维持机体O平衡，弥补机体的缺氧反应。

低氧诱导因子HIF是由和亚基组成的一种异质二聚体的转录因子，参与了动物缺氧应激的适应和生存过程，在维持机体氧稳态中发挥至关重要的作用。和亚基均包含基本的螺旋-环-螺旋结构基序和PAS结构域。在常氧条件下，脯氨酰羟化酶PHD通过氧依赖性降解结构域ODD中2个保守的脯氨酸残基的羟基化作用，使靶蛋白HIF亚基羟基化，随之羟基化的HIF亚基被VHL蛋白识别并泛素化，介导蛋白降解。HIF激活细胞中一系列缺氧诱导基因的转录，以应对缺氧环境。在脊椎动物中HIF至少有3个亚型，分别为HIF1、HIF2和HIF3。鱼类中的研究已经证明，HIF1主要在无氧呼吸中间体的氧气摄取和运输中起关键作用，而HIF2在血管和红细胞的生成发挥重要作用。目前，关于HIF亚型的研究已在多种鱼类中开展，而在耐低氧的鲫鱼中的研究还鲜见报道。基于此，本研究基于前期对草海鲫鱼转录组数据分析，利用生物信息学技术和PCR，克隆获得了鲫鱼中HIF 2个亚型和的全长 cDNA序列，并进行了结构和功能分析。此外，利用实时荧光定量PCR分析了鲫鱼中和mRNA在不同组织中的表达情况，以期为进一步深入探究鲫鱼耐低氧分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集

于2018年在贵州威宁县草海采集鲫鱼[体长(14.98±4.25) cm；体质量(68.71±5.25) g]，取其肠、肝脏、鳃、心脏、肾脏、肌肉、脾脏、精巢、卵巢和全血组织样品，放入RNA Later(Tiangen)中，采样点：26°51′24.15″N，104°12′31.57″E，海拔：2 168.09 m。另采集3尾鲫鱼带回实验室，取其肝脏组织，液氮冷冻后置于-80 ℃低温冰箱保存，用于后续RNA提取。

1.2 鲫鱼Ca-HIF1α和Ca-HIF2α全长的克隆与生物信息学分析

提取鲫鱼肝脏组织总RNA，将RNA反转录为cDNA(TaKaRa PrimeScript Ⅱ 1st Stramd cDMA Synthesis Kit)。从鲫鱼转录组数据库筛选和基因片段，使用DNAstar SeqMan软件对筛选的目的片段进行拼接。根据拼接获得的和基因序列设计特异性引物，由表1可知，对拼接获得序列的正确性进行验证，克隆获得和基因的全长cDNA序列。利用DNAMAN软件分析和基因全长cDNA序列中开放阅读框及其编码的氨基酸序列，SMART(http：//smart.embl-heidelberg.de/)分析和基因编码氨基酸序列的功能域，ExPASy(http：//web.expasy.org/protparam)分析和基因编码蛋白质的分子质量和等电点(pI)。

表1 Ca-HIF1α和Ca-HIF2α基因序列扩增和qRT-PCR引物序列

1.3 HIF1α和HIF2α序列比对和系统进化树的构建

利用Clustal X软件比对鲫鱼与其他物种的和基因亚型翻译的氨基酸序列的同源性，并用MEGA 4.0软件进行同源与聚类分析，采用邻接法NJ构建系统进化树，500次自举(Bootstrap)重复检验进化树的置信度。表2为各物种序列登录号，来自GenBank。

表2 序列比对和构建进化树物种信息

1.4 鲫鱼Ca-HIF1α和Ca-HIF2α mRNA表达模式分析

分别提取肠、肝脏、鳃、心脏、肾脏、肌肉、脾脏、精巢、卵巢和全血组织的RNA，将RNA反转录为cDNA(TaKaRa SYBR Premix Ex)，根据和基因全长cDNA序列设计特异性引物，鲫鱼-基因作为内参，由表1可知引物序列，每个样本设计3个平行重复，使用BioRad CFX96TM Real-Time PCR检测系统对和mRNA在不同组织中的表达模式进行分析。

1.5 数据分析

使用Bio-Rad CFX Manager软件分析熔解曲线，通过2-ΔΔ分析和mRNA的相对表达水平。采用GraphPad Prism 5.0统计软件中的One-way ANOVA对和mRNA在鲫鱼不同组织相对表达量进行分析，<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 鲫鱼HIF-1α和HIF-2α cDNA序列分析

克隆获得鲫鱼中和cDNA全长序列(GenBank NO.：MW916102，MW916103)，将其分别命名为和。由图1可知，全长共有3 867 bp，其中，5′UTR为295 bp，3′UTR为1 247 bp，开放阅读框2 322 bp，编码774个氨基酸。由图2可知，cDNA全长共4 647 bp，其中5′UTR为175 bp，3′UTR为 2 023 bp，开放阅读框2 460 bp，编码820个氨基酸。生物信息学分析预测和基因编码蛋白质的分子质量分别为85.844、91.228 ku，等电点为5.12和6.20。SMART在线分析见图3。由图3可知，二者具有HLH、PAS和PAC结构域，此外，多序列比对结果显示二者还具有ODD、N-TAD 和C-TAD功能域。

2.2 HIF1α和HIF2α亚型的同源性分析以及系统进化树的构建

多序列比对结果见图4。由图4可知，鲫鱼 Ca-HIF1α 第27个氨基酸是丝氨酸(S)，而Ca-HIF2α相对应的第25个氨基酸是半胱氨酸(C)。Ca-HIF1α和Ca-HIF2α氨基酸序列不仅具有ODD、N-TAD和C-TAD 3个结构域，且ODD结构域具有2个保守的脯氨酸(P)位点，其中，1个是LxxLAP位点，该位点的序列并没有发生突变。此外，C-TAD结构域均具有保守的天冬酰胺(N)位点，表明Ca-HIF1α 和Ca-HIF2α结构域的保守性。进化树显示，Ca-HIF1α和Ca-HIF2α分别与其他物种中相应的亚型聚为一支。但Ca-HIF1α是先与花斑裸鲤、纳木错裸鲤、扁咽齿鱼、黄河裸裂尻鱼、齐口裂腹鱼、鲤鱼的HIF1α聚为一支后，再与南亚野鲮的HIF1α聚为一支，最后与白鲢、草鲤鱼和团头鲂的HIF1α聚在一起。与之不同，白鲢、草鲤鱼和团头鲂HIF2α先聚为一支，南亚野鲮、齐口裂腹鱼、花斑裸鲤、纳木错裸鲤、黄河裸裂尻鱼和扁咽齿鱼聚为一支，然后2支汇聚，最后再与Ca-HIF2α聚在一起，提示Ca-HIF2α比Ca-HIF1α进化得要快。

2.3 Ca-HIF1α和Ca-HIF2α mRNA在鲫鱼不同组织中的表达

由图5可知，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示，和mRNA在所有被检测的组织中均有表达，其中，mRNA在所有组织中的相对表达量均高于mRNA的表达量。此外，mRNA在肝脏、鳃和精巢组织中的相对表达量最高，全血、心脏、肾脏、肌肉、脾脏和卵巢组织中的相对表达量次之，在肠组织中的相对表达量最低。与之相似，mRNA在肝脏、鳃和全血组织中的相对表达量最高，卵巢、精巢、脾脏、心脏、肾脏和肌肉组织中的相对表达量次之，在肠组织中的相对表达量最低。

3 讨论

3.1 鲫鱼中Ca-HIF1α和Ca-HIF2α基因序列与系统进化分析

本研究克隆获得鲫鱼中基因2个亚型的全长cDNA序列，对序列比对构建进化树显示二者分别与其他物种中的HIF1α和HIF2α聚为一支。因此，将其分别命名为和。与其他物种中的同源蛋白一样，Ca-HIF1α和Ca-HIF2α均具有HLH、PAS-A、PAS-B、PAC、N-TAD和C-TAD 6个结构功能域，表明组成HIF1α和HIF2α的主要结构域是高度保守的。与巨鲷()和HIF1α相关研究结果一致，Ca-HIF1α第27个氨基酸是丝氨酸(S)，Ca-HIF2α对应位点的第25个氨基酸是半胱氨酸(C)，HIFα中HLH结构域中还原性半胱氨酸的存在主要与介导动物的氧敏感性有关，此不同之处导致Ca-HIF2α在DNA结合过程中可能比Ca-HIF1α对氧化还原更敏感。Ca-HIF1α与Ca-HIF2α结构上的这些区别可能导致二者具有各自独特的功能，且Ca-HIF2α在系统进化中比Ca-HIF1α要快。然而，Ca-HIF1α和Ca-HIF2α在ODD结构域均具有2个保守的脯氨酸(P)，且与人类中的HIFα同源蛋白相似，保有了LxxLAP位点，LxxLAP位点的突变是动物适应高原低氧环境的重要标志，这可能与鲫鱼是耐低氧动物有关。此外，Ca-HIF1α和Ca-HIF2α在C-TAD结构域均具有天冬酰胺，2个保守的脯氨酸主要参与了蛋白质周转，天冬酰胺主要参与诱导靶基因的转录，这些残基的保守性，表明其在促进鱼类和哺乳动物的转录活性方面具有功能保守性。

3.2 鲫鱼不同组织中Ca-HIF1α和Ca-HIF2α mRNA水平表达差异分析

实时荧光定量PCR结果显示，在常氧条件下，和mRNA在所检测组织(肠、肝脏、鳃、心脏、肾脏、肌肉、脾脏、精巢、卵巢和全血)中均有表达，与巨鲷()、斑马鱼、齐口裂腹鱼()和软刺裸鲤()中研究结果相一致，和mRNA在鳃组织中的表达量均最高。此外，与巨鲷()相似，mRNA在鲫鱼肝脏和精巢组织中的表达量均很高。而mRNA在卵巢组织中表达量较高，mRNA在卵巢组织中的表达量较低。与同时耐低氧的草鱼中结果不同，和mRNA在鲫鱼的肾脏组织中表达量均不高。和mRNA在鲫鱼肠组织中的低表达，可能是由于肠道组织水平的日常变化，二者参与了肠道稳态的维持。以上结果说明-在维持机体氧稳态方面发挥至关重要作用，但和这2个亚型mRNA水平的表达差异性表明二者在调控氧稳态方面具有分工。此外，二者在精巢、卵巢和全血组织中的表达，推测其可能参与介导了血细胞和生殖细胞的发育。