何跃徐航冯德超曹德宏艾建忠杨璐魏强

(1.遂宁市中心医院泌尿外科,四川 遂宁 629000;2.四川大学华西医院泌尿外科/泌尿外科研究所,成都 610041)

良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)是中老年男性排尿困难最常见的原因之一,主要表现为前列腺细胞增生致体积增大[1]。BPH的病理生理仍然不完全清楚[2]。以前普遍认为BPH的发生是年龄、遗传和种族等不可逆转的危险因素引起的。但是目前研究发现了一些可逆转的危险因素,包括体力劳动、饮酒、饮食等生活方式,代谢综合征(metabolic syndrome,MetS)及其亚组成分如肥胖、糖尿病、血脂异常等,性激素紊乱和前列腺组织炎症[3]。其中前列腺组织炎症在BPH的发生、发展过程中发挥了不可忽视的作用。研究表明以针对前列腺组织炎症为目标的治疗,可以缓解BPH的进展,提高临床疗效[4]。体外细胞实验也证明了炎症因子能够刺激前列腺细胞增生[5]。

MetS是一种自身代谢水平紊乱的病理状态,包括腹型肥胖、高血压、血脂异常、血糖增高等[6]。研究证明MetS(特别血脂异常)与前列腺组织炎症程度有关;MetS及其亚组成分显著增加了前列腺组织标本中的炎症指数[7]。高甘油三酯、高血糖是导致较严重的前列腺组织炎症的独立危险因素。因此,高脂可能促进前列腺组织炎症,这也是BPH发生和发展的关键因素。

生物钟即昼夜节律,对人体健康的影响越来越受到人们的关注。研究表明昼夜节律紊乱的人患糖尿病、肥胖、抑郁症和癌症等慢性疾病的几率显著增加[8-9]。细胞核受体Rev-erb,包括Rev-erbα和Rev-erbβ,它们的编码基因分别为NR1D1和NR1D2,是生物钟至关重要的组件,在维持昼夜节律方面起着重要的作用[10]。研究证明Rev-erbα在核心生物钟和免疫炎症通路之间起着关键的桥梁作用[11]。生物钟蛋白Rev-erbα能够调节机体的代谢活动;另外研究表明生物钟蛋白Rev-erbα能够降低组织的炎症水平[12]。因此,利用高脂饮食诱导小鼠前列腺组织产生炎症,通过Rev-erbα激动剂(SR9009)进行腹腔注射,验证Rev-erbα激动剂是否能够降低小鼠前列腺组织的炎症水平,并探究其可能的信号通路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

40只6周龄健康SPF级雄性C57B/6J小鼠,体重18 ~ 20 g,购自成都达硕生物有限公司【SCXK(川)2020-030】。小鼠分笼喂养,自由进食饮水,饲养室温度(22 ± 3)℃,湿度为50% ~ 70%,房间每12 h光照/黑暗循环,饲养于成都达硕生物有限公司【SYXK(川)2019-189】。操作符合成都达硕公司实验动物伦理要求(伦理批号:Dossy20200106001)。

1.1.2 主要试剂与仪器

Anti-IL-8(ABclonal,A2541),Anti-CCL21(Abcam,ab231116),Anti-IL-6(Servicebio,GB11117),Anti-IL-1β(Abcam,ab234437),Anti-NF-κB P65(ABclonal,A11202)。动物手术器械 (FST公司,ZRFST002,瑞士),PXS体视显微镜(上海普丹光学仪器公司,中国),光学显微镜 CH-2(Olympus公司,日本),石蜡切片机 RM2016(Leica公司,德国)。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组

将小鼠分为4组,每组10只:普通饮食组;高脂饮食组;高脂饮食 + SR9009组;高脂饮食 + control组。高脂饮食饲料购自美国RESEARCH DEITS公司(D12492)。喂养7周后高脂饮食 + SR9009组小鼠开始腹腔注射SR9009(100 mg/kg),每天早晚8:00各1次,持续3周;高脂饮食 + control组小鼠每天腹腔注射药物对照溶剂(见图1)。

图1 小鼠分组和饲养处理流程图Figure 1 Time flow chart of mice grouping and feeding processing

1.2.2 小鼠腹腔注射液体配制

蓖麻油100 μL和无水乙醇100 μL按照1∶1混合后溶解SR9009 30 mg,超声超溶见无沉淀。注射前,生理盐水稀释为总体积1 mL,SR9009注射液终浓度为0.03 mg/mL。药物对照溶剂注射液体:蓖麻油100 μL和无水乙醇100 μL按照1∶1混合,注射前生理盐水稀释至总体积1 mL。每只小鼠每次腹腔注射约100 μL。

1.2.3 取材及样本处理

小鼠麻醉后,采血者左手捏住小鼠后颈部皮肤,将小鼠置于桌面并固定好;右手用刀片猛扎小鼠两侧耳后颈静脉体表投影处。迅速将小鼠头向下,使小鼠血液滴入EP管内,静置2 h,4℃ 4500 rpm 离心15 min,取上清液检测血清甘油三酯、总胆固醇。取血后,将小鼠放平,腹部向上,耻骨联合处剪开,进入腹腔。在耻骨后方用镊子将膀胱及前列腺全部夹出。在体视显微镜下分离前列腺,仔细清理表明的筋膜和脂肪组织,置于精密电子天平称前列腺重量。前列腺指数(prostatic index,PI)是反应小鼠前列腺增生情况的指数,具体计算方法为前列腺重量/体重。每组前列腺组织分成3份:(1)放入RNA Later液后送北京诺禾致源公司完成转录组测序;(2)放入液氮保存备用;(3)放入4%多聚甲醛液固定后病理切片HE染色和免疫组化检测。

1.2.4 转录组测序结果分析

分析4组小鼠前列腺组织测序结果,在每组间的差异基因中,通过富集炎症相关通路基因,筛选表达水平在高脂饮食组较普通饮食组上调;而在高脂饮食 + SR9009组较高脂饮食 + control组下调的相关基因。

1.2.5 免疫组化

免疫组化使用免疫酶法检测,其一抗稀释比例分别为IL-6(1∶600),IL-8(1∶50),IL-1β(1∶800),NF-κB-P65(1∶200),CCL21(1∶100)。具体方法见操作说明书。

1.2.6 HE染色和免疫组化结果判定

按照国际前列腺炎组织学诊断与分度标准[13],对前列腺组织炎症程度以炎症细胞浸润程度进行分级;根据Axiotis方法[14],高倍镜(200倍)下染色阳性细胞数百分比,结合染色强度综合计分。染色强度以多数细胞呈现的染色特性计分:无着色为0分,浅黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。阳性细胞百分比即某类细胞5个视野(每高倍视野计数100个此类细胞)的阳性细胞平均数:0% ~ 5%为0分,6% ~ 25%为1分,26% ~ 50%为2分,51% ~ 75%为3分,＞75%为4分。染色强度与阳性细胞百分比的乘积:0分为阴性,1 ~ 4分为弱阳性,5 ~ 8分为中度阳性,9 ~ 12分为强阳性。

1.3 统计学分析

计量资料用平均值 ± 标准差(±s)描述,多组数据间的差异性分析采用方差分析(One-way ANOVA);计数资料采用χ2检验。当P＜ 0.05时,认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠体重变化

6周龄雄性小鼠连续喂养7周,高脂饲料的小鼠体重明显重于普通饲料的小鼠。喂养第8周开始高脂饮食 + SR9009组和高脂饮食 + control组小鼠开始分别腹腔注射SR9009和溶剂对照,腹腔注射3周后,高脂饮食 + SR9009组小鼠与单纯高脂饮食小鼠比,体重下降明显,高脂饮食 + control组小鼠与单纯高脂饮食小鼠比较体重无明显差别(见表1)。

表1 小鼠体重变化表(±s, n = 10)Table 1 Body weight of mice(±s, n = 10)

表1 小鼠体重变化表(±s, n = 10)Table 1 Body weight of mice(±s, n = 10)

注:与普通饮食组比较,ΔP ＜ 0.01;与高脂饮食 + control组比较,*P ＜ 0.05。Note.Compared with the normal diet group, ΔP ＜ 0.01.Compared with the high-fat diet + control group, *P ＜ 0.05.

组别Groups 6周龄(g)6 weeks old(g)13周龄(g)13 weeks old(g)16周龄(g)16 weeks old(g)普通饮食组Normal diet group 19.13 ± 0.43 27.23 ± 0.70 28.75 ± 0.88高脂饮食组High-fat diet group 19.05 ± 0.69 30.85 ± 2.56Δ 33.29 ± 3.33Δ高脂饮食 + SR9009组High-fat diet + SR9009 group 19.10 ± 0.30 32.55 ± 3.21 29.21 ± 1.62*高脂饮食 + control组High-fat diet + control group 18.90 ± 0.44 32.30 ± 2.88 32.64 ± 2.72

2.2 前列腺重量和血清甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)水平

高脂饮食组小鼠前列腺重量、前列腺指数大于普通饮食组,而高脂饮食 + SR9009组小鼠前列腺重量、前列腺指数小于高脂饮食 + control组。相较于普通饮食组小鼠,高脂饮食组小鼠血清TG、TC明显增高,高脂饮食 + SR9009组小鼠血清TG、TC明显低于高脂饮食 + control组(见表2)。

表2 4组实验小鼠的前列腺重量和血脂指标对比表(±s, n = 10)Table 2 Comparison of prostate weight and blood lipid indexes of mice(±s, n = 10)

表2 4组实验小鼠的前列腺重量和血脂指标对比表(±s, n = 10)Table 2 Comparison of prostate weight and blood lipid indexes of mice(±s, n = 10)

注:与普通饮食组比较,ΔP ＜ 0.01,ΔΔP ＜ 0.0001;与高脂饮食 + control组比较,*P ＜ 0.05;与高脂饮食 + control组比较,$P ＜ 0.05;与高脂饮食 + control组比较,&P ＜ 0.0001。Note.Compared with the normal diet group, ΔP ＜ 0.01, ΔΔP ＜ 0.0001.Compared with high-fat diet + control group, *P ＜ 0.05.Compared with the high-fat diet + control group, $P ＜ 0.05.Compared with the high-fat diet + control group, &P ＜ 0.0001.

组别Groups前列腺重量(mg)Prostate weight(mg)前列腺指数Prostatic index甘油三酯(mmol/L)Triglyceride (mmol/L)胆固醇(mmol/L)Cholesterol (mmol/L)普通饮食组Normal diet group 91.00 ± 17.00 3.09 ± 0.52 1.03 ± 0.13 2.73 ± 0.15高脂饮食组High-fat diet group 129.00 ± 30.81Δ 4.06 ± 0.54Δ 1.46 ± 0.09# 5.66 ± 1.01ΔΔ高脂饮食 + SR9009组High-fat diet + SR9009 group 131.00 ± 28.09* 3.37 ± 0.48 $ 1.49 ± 0.16& 5.68 ± 1.22 $高脂饮食 + control组High-fat diet + control group 99.00 ± 13.00 4.30 ± 0.62 0.76 ± 0.15 4.46 ± 0.78

2.3 前列腺组织炎症情况

小鼠前列腺切片HE染色,显微镜下高脂饮食组较普通饮食组小鼠前列腺间质内有更多的炎性细胞浸润。高脂饮食 + SR9009组较高脂饮食 + control组小鼠前列腺组织间质内炎性细胞浸润明显减少(见图2)。

2.4 前列腺组织转录组测序

小鼠前列腺组织转录组测序,其中趋化因子21a(Ccl21a)、趋化因子受体7(Ccr7)、Toll样受体4(Tlr4)、白介素6(Il6)、白介素1β(Il1b)、c-x-c基趋化因子受体2(Cxcr2,IL-8受体)在高脂饮食组的表达水平较普通饮食组上调;而其在高脂饮食 + SR9009组的表达水平较高脂饮食 + control组下调(见图3)。

注:黑色箭头表示炎症细胞。图2 小鼠前列腺HE染色Note.Black arrows indicate inflammatory cells.Figure 2 HE staining of prostate

图3 4组小鼠前列腺组织NF-κB通路中差异基因热图分析Figure 3 Heat map analysis of differential genes in NF-κB pathway in prostate tissue of mice

2.5 免疫组化(IHC)检测前列腺组织IL-6、IL-8、IL-1β、NF-κB-P65和CCL21a的表达

炎症因子IL-6、IL-8、IL-1β和NF-κB家族中的P65在普通饮食组小鼠前列腺组织中几乎不表达,高脂饮食 + SR9009组小鼠前列腺组织中表达呈弱阳性,高脂饮食组小鼠前列腺组织中表达呈中等阳性,高脂饮食 + control组小鼠前列腺组织中表达呈强阳性(见图4,表3)。普通饮食组和高脂饮食 + SR9009组小鼠前列腺间质内黄色颗粒浅淡,CCL21a表达呈弱阳性;高脂饮食组和高脂饮食 + control组小鼠前列腺间质内有大量深染的棕黄色颗粒,CCL21a表达呈强阳性(见图5,表3)。

表3 四组实验小鼠的前列腺组织免疫组化评分结果Table 3 IHC scoring of prostate tissue in four groups of mice

图5 四组小鼠前列腺组织免疫组化检测CCL21aFigure 5 IHC detection of CCL21a in prostate tissue of four groups of mice

3 讨论

前列腺炎的动物模型主要是经尿道或者局部注射细菌或者药物引起[15],属于有创操作,对动物的惊扰大,形成的是急性炎症,不能模拟前列腺组织慢性炎症的要求。我们选择高脂饮食喂养诱导小鼠前列腺组织慢性炎症。通过高脂饲料喂养10周后,高脂饮食组小鼠的体重明显大于普通饮食组;高脂饮食组小鼠血清内甘油三酯、胆固醇的浓度也明显高于普通饮食组。此外,在高脂饮食的诱导下,高脂饮食组小鼠的前列腺重量、前列腺指数大于普通饮食组。HE染色提示高脂饮食组小鼠前列腺组织间质内较普通饮食组有更多的炎症细胞浸润。IHC检测提示高脂饮食组小鼠前列腺组织内炎性细胞因子IL-1β、IL-6和IL-8的表达水平较普通饮食组高。这说明我们使用高脂饮食喂养小鼠模拟人体肥胖、脂代谢异常致代谢综合征,并发生前列腺组织炎症的模型是成功的。

在Rev-erb激动剂的化合物中,SR9009因为有更高的有效性和稳定性,认为是目前最适合用于体内的Rev-erb激动剂[16]。文献报道对葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎小鼠给予SR9009药物干预后,能够激活结肠的Rev-erbα的功能,降低小鼠结肠的炎症水平[17]。因此,我们选择SR9009作为本次小鼠实验的干预药物。

高脂饮食 + SR9009组较高脂饮食 + control组小鼠前列腺重量减轻,前列腺指数减小;前列腺HE染色后发现高脂饮食 + SR9009组较高脂饮食 + control组前列腺组织的炎症细胞浸润减少;IHC检测发现高脂饮食 + SR9009组较高脂饮食 + control组小鼠前列腺组织中炎症因子IL-6、IL-8和IL-1β的表达水平降低。这说明,使用SR9009后,能够降低高脂饮食后小鼠前列腺组织的炎症水平,小鼠前列腺重量和前列腺指数也较对照组减小,说明激动Rev-erbα功能可以减轻小鼠前列腺组织的炎症水平,通过控制前列腺组织的炎症水平抑制前列腺组织的增生。

CCL21属于CC类趋化因子家族,是一种小分子分泌蛋白,是首个被证明具有介导淋巴细胞归巢的趋化因子[18]。研究证实CCL21同细胞膜上的C-C类趋化因子受体7(C-C Motif Chemokine Receptor 7,CCR7)发生结合,进而参与组织的炎症反应。CCR7启动子包含了与NF-κB的结合位点,两者结合后可激活下游NF-κB信号通路引起炎症反应过程[19]。小鼠前列腺组织免疫组化提示普通饮食组小鼠和高脂饮食 + SR9009组小鼠前列腺组织中CCL21a的表达低,而高脂饮食组和高脂饮食 + control组小鼠前列腺组织中CCL21a的表达高。说明SR9009能够降低前列腺组织CCL21的分泌,从而抑制下游的NF-κB通路。

4组小鼠前列腺组织测序的差异基因热图分析,NF-κB通路中Ccl21a、Ccr7、Tlr4、Il6、Il1b、Cxcr2的表达水平存在差异。IHC检测小鼠前列腺组织IL-6、IL-8、IL-1β的表达差异与测序结果吻合。课题组前期对120例BPH患者进行回顾性研究发现,前列腺组织NF-κB(P50和P65)的表达强度与前列腺组织炎症程度高度一致[20]。因此,对4组小鼠的前列腺组织进行IHC检测P65,其P65的表达强度趋势与组织炎症程度一致,这同样与转录组测序结果吻合。说明SR9009通过激活Rev-erbα活性能够降低前列腺组织CCL21的表达,并通过其下游NFκB信号通路调控前列腺组织炎症水平。