郭檬檬，姚昶

乳腺癌是严重威胁女性身心健康的恶性肿瘤之一，近年来乳腺癌的发病率呈上升趋势，并且病人趋于年轻化。早期诊断、及早治疗是提高乳腺癌病人疗效、改善预后的关键［1］。已有研究证实，微小RNA（microRNA，miRNA）在乳腺癌的发生发展中起重要调节作用，但循环miRNA含量比组织内少，并且易被RNA酶降解［2-3］。随着研究的不断深入，有学者认为血清中的miRNAs可能通过外泌体的形式进行运输，实现细胞间的信息传递作用［4-5］。由外泌体包裹运输的miRNA含量较为稳定，可较为真实地反映母细胞的miRNA水平。研究发现，miR-155可直接靶向FOXO-3a的3’-端非翻译区下调其转录及翻译，从而调节乳腺癌细胞的药物反应［6］。另有研究称，miR-222在乳腺癌病人外泌体中过表达，与乳腺癌病人阿霉素耐药有关［7］。然而，关于外泌体miR-155、miR-222与乳腺癌病人复发转移的相关研究鲜见报道，因此本研究通过检测血清外泌体miR-155、miR-222表达水平，并初步分析其与乳腺癌病人术后复发转移的关系，以期为临床治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2016年1月至2017年6月南通市中医院收治的乳腺癌病人72例作为乳腺癌组，病人均为女性，年龄范围27～71岁，年龄（50.46±7.24）岁，其中左侧37例，右侧45例；TNM分期Ⅰ期31例，Ⅱ～Ⅲ期41例；无淋巴结转移40例，有淋巴结转移32例；低、中分化34例，高分化38例。纳入标准：①经病理组织切片证实为原发性病灶浸润性乳腺癌；②均行乳腺癌改良根治术进行治疗；③术前行乳腺彩色超声检查；④临床资料完整。排除标准：①非原发性乳腺癌；②合并恶性肿瘤；③合并血液系统疾病或传染性疾病；④孕妇、哺乳期女性。同期选取在本院确诊的乳腺纤维瘤病人40例为对照组，均为女性，年龄范围25～67岁，年龄（48.62±8.17）岁。所有病人及其近亲属均知情同意并签署知情同意书。本研究方案经南通市中医院伦理委员会批准实施（批号20160211）。

1.2 方法

1.2.1 血样采集及外泌体提取 所有病人于入院次日清晨取空腹静脉血5 mL，对照组于检查当日取空腹静脉血5 mL，3 000 r/min离心10 min后，取上层清液转移至干净EP管，做好编号后置于-80℃条件下保存。利用外泌体试剂盒提取血清中外泌体，置于透射电镜下观察形态进行鉴定。外泌体试剂盒购自德国QIAGEN公司，提取步骤按照说明书严格执行。

1.2.2 荧光定量PCR技术检测外泌体miR-155、miR-222水平 利用Trizol试剂盒提取血清外泌体总RNA，富集miRNAs后按照microRNA Reverse Transcription Ki（t美国Thermo Fishier Scientific）说明书方法进行血清外泌体miRNAs逆转录反应，将得到的cDNA按照SYBR Green Supermix（美国Bio-Red）说明书进行实时荧光定量PCR分析，反应条件如下：95℃变性30 s；95℃、15 s；60℃延伸15 s，40个循环。miR-155、miR-222均以U6为内参，引物序列为：miR-155正向引物5’-ACGCTCAGTTAATGCTAATCGTGATA-3’，miR-155反 向引 物5’-ATTCCATGTTGTCCAACTGTCTCTG-3’；miR-222正向引物5’-GCTGGCGACATTACGACATTCGCGC-3’，miR-222反 向 引 物5’-ACGCGCTAAGCCAAGTCTTAC-3’；U6正向引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，U6反向引物5’-AACGCTTCCAGAATTTGCGT-3’。用2-ΔΔCt法计算各血清外泌体中miR-155、miR-222相对表达水平。每个样品重复3次，取平均值。

1.2.3 观察指标 乳腺癌病人术后第一年每3个月随访一次，之后每6个月随访一次至术后3年。随访时病人行全身CT或MRI扫描，如发现影像学转移，则进一步行组织病理学检查确诊，根据病人是否发生复发转移分为复发转移组27例和未复发转移组45例，比较两组病人血清外泌体miR-155、miR-222水平。

1.3 统计学方法用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料以表示，两组间比较采用t检验；计数资料用例（%）表示，行χ2检验。采用受试者工作特征（ROC）曲线评价血清外泌体miR-155、miR-222水平对乳腺癌病人术后复发转移的预测价值。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究组和对照组血清外泌体miR-155 、miR-222 水平比较研究组血清外泌体miR-155、miR-222水平均明显高于对照组（均P＜0.05），见表1。

表1 乳腺纤维瘤病人40例与乳腺癌病人72例血清外泌体miR-155、miR-222水平比较/

组别对照组研究组t值P值例数40 72 miR-155 0.98±0.03 1.46±0.62 4.88＜0.001 miR-222 1.02±0.02 1.87±0.79 6.79＜0.001

2.2 复发转移组和未复发转移组血清外泌体miR-155 、miR-222 水平比较复发转移组病人血清外泌体miR-155、miR-222水平均明显高于未复发转移组（均P＜0.05），见表2。

表2 乳腺癌病人72例复发转移组和未复发转移组血清外泌体miR-155、miR-222水平比较/

表2 乳腺癌病人72例复发转移组和未复发转移组血清外泌体miR-155、miR-222水平比较/

组别复发转移组未复发转移组t值P值例数27 45 miR-155 1.68±0.47 1.33±0.24 4.18＜0.001 miR-222 2.13±0.53 1.71±0.26 4.50＜0.001

2.3 乳腺癌病人血清外泌体miR-155 、miR-222 水平与临床病理参数之间的关系以血清外泌体miR-155、miR-222相对表达量的平均数将病人分为高表达组和低表达组，经病理分析结果显示，乳腺癌病人血清外泌体miR-155、miR-222表达水平与年龄、肿瘤大小、分化程度无关（均P＞0.05），与TNM分期、淋巴结转移有关（均P＜0.05），见表3。

表3 乳腺癌病人72例血清外泌体miR-155、miR-222水平与临床病理参数之间的关系/例（%）

2.4 血清外泌体miR-155 、miR-222 水平对乳腺癌病人术后复发转移的诊断价值ROC结果显示，血清外泌体miR-155、miR-222预测乳腺癌病人术后复发转移的曲线下面积（AUC）分别为0.82［95%CI：（0.71，0.87）］、0.79［95%CI：（0.68，0.88）］，对应的灵敏度分别为69.37%、59.26%，特异度分别为80.22%、86.33%；二者联合预测乳腺癌病人术后复发转移的AUC为0.89［95%CI：（0.79，0.95）］，灵敏度为84.37%，特异度为93.16%。进一步Z检验结果显示，血清外泌体miR-155、miR-222单独预测乳腺癌病人术后复发转移的AUC与联合预测的AUC相比，均差异无统计学意义（Z=1.04，P=0.298；Z=1.29，P=0.196）。

3 讨论

乳腺癌是一种高度异质性肿瘤，临床研究发现，约有30%～40%的早期乳腺癌病人即使接受了手术根治术，仍有复发转移的风险，可能与其基因异质性导致的生物学行为和临床病理改变有关［8-9］。本研究纳入的72例乳腺癌病人，有27例发生复发转移，复发转移率为37.50%，与其他学者［10］报道的39.53%较为接近。目前临床上诊断乳腺癌常用方法有影像学检查、病理学诊断及血清肿瘤标志物检查等，但由于存在放射性损伤、有创性、灵敏度较差等缺陷，且对病人术后复发转移预测价值有限，寻找新的有效标志物以监测乳腺癌术后复发转移成为目前研究的热点。

外泌体是内泌体衍生的纳米大小的小泡（50～150 nm），由多种类型细胞分泌，外泌体中含有细胞蛋白、脂质和miRNAs，可通过转运mRNA或miRNA调控受体细胞基因表达，癌细胞分泌的外泌体从原发肿瘤转移到循环系统已在多种模型中得到证实［11-13］。已有学者报道称从乳腺癌病人和健康志愿者血清中分离出的外泌体中含有miR-155［14］，Kia等［15］研究发现，miR-155在转移性乳腺癌外泌体中富集，且通过靶向PTEN和DUSP14参与乳腺癌细胞的侵袭、转移作用。本研究结果显示，与对照组相比，乳腺癌病人血清外泌体miR-155呈高表达，且复发转移病人血清外泌体miR-155水平亦明显高于未复发转移病人。经病理分析发现，血清外泌体miR-155的表达水平与乳腺癌病人TNM分期、淋巴结转移有关，表明外泌体miR-155可能通过独特的信息传递作用参与乳腺癌细胞的增殖、迁移，影响疾病进展。外泌体由于具有较高稳定性，在细胞外环境中可防止RNA酶、蛋白酶的降解作用，同时发挥独特的细胞间信息传递功能［16］，但关于外泌体miR-155在乳腺癌中的具体作用机制有待进一步研究。

研究发现，miR-222是最早发现的一类外泌体miRNAs，可通过在肿瘤基质、耐药细胞及非耐药细胞之间相互传递信息，从而改变肿瘤微环境，进而使肿瘤细胞产生耐药性［17-18］。也有人认为，外泌体可能通过囊泡将抗肿瘤药物隔离，再通过胞吐作用将其排出细胞，以消除药物对细胞的毒害作用，促进肿瘤细胞增殖、分化、转移［19］。Yu等［7］体外细胞实验研究发现，转染miR-222模拟物的乳腺癌细胞MCF-7/S获得阿霉素耐药，而转染miR-222抑制剂的MCF-7/S细胞失去耐药性，证实miR-222可能是引起乳腺癌病人耐药的机制之一。另有研究发现，外泌体miR-222在伴有淋巴结转移的乳腺癌细胞中高表达，进一步研究证实外泌体miR-222通过下调肿瘤抑制基因PDLIM2，从而激活NF-KB信号通路，促进肿瘤细胞迁移、侵袭作用［20］。本研究结果显示，miR-222在乳腺癌病人血清外泌体中表达水平明显高于对照组，与病人TNM分期、淋巴结转移有关，与上述结果一致，提示乳腺癌病人血清外泌体miR-222可能通过在肿瘤局部微环境中传递信息，激活一条或多条信号通路，从而参与肿瘤的发生发展过程。本研究还发现，术后复发转移病人血清外泌体miR-222水平明显高于未复发转移，提示血清外泌体miR-222可能作为乳腺癌病人复发转移的生物标志物。

ROC曲线可用于评价临床诊断价值，AUC为ROC曲线与横轴之间的面积，其大小可反映诊断价值大小，一般AUC值大于0.5，认为具有诊断价值，AUC值越大则诊断价值越高。本研究结果显示，外泌体miR-155、miR-222水平预测乳腺癌病人术后复发转移的AUC分别为0.82、0.79，预测敏感性较低，分别为69.37%、59.26%。为提高预测效果，进一步探究二者联合预测价值，结果显示二者联合预测乳腺癌病人术后复发转移的AUC为0.885，均高于单独预测AUC，但差异无统计学意义，联合诊断的灵敏度为84.37%，特异度为93.16%，提示二者联合诊断对乳腺癌术后复发转移的预测效能更优，后续应纳入更大样本量对本研究结果进行验证。

综上所述，乳腺癌病人血清外泌体miR-155、miR-222水平呈高表达，与TNM分期、淋巴结转移有关，二者对病人术后复发转移均有一定的预测价值，且二者联合预测价值更高，提示血清外泌体miR-155、miR-222可能成为预测乳腺癌术后复发转移的潜在生物标记物，但具体作用机制有待更深入研究。