黄丽芸 陈小兵

齿瓣石豆兰为兰科石豆兰属植物，分布在江西、广西、福建、广东、浙江等地，文献[1-4]记载具有滋阴降火、清热消肿之功效，可用于急性咽炎、扁桃体炎等，野生品种较少，具有较高的药用价值。本研究以简单重复序列间扩增（ISSR）分子标记技术从遗传多样性方面对其分析研究，探究不同产地齿瓣石豆兰遗传多样性及亲缘关系，为各地齿瓣石豆兰的资源开发提供基础研究数据。

1 材料与方法

1.1 试药

采集江西省赣州市、江西省遂川县、广东省罗浮山等地的野生齿瓣石豆兰，经江西中医药大学国家二级技师颜干明鉴定为齿瓣石豆兰。见表1。

表1 采集信息

1.2 试剂与仪器

试剂：Taq Plus DNA 聚合酶（翌圣生物科技（上海）股份有限公司，批号：10101ES80）、DNA 提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司，批号：DP321-03）、灭菌用水等。

仪器：PCR反应扩增仪（BBI，型号：PCR-96）、凝胶电泳仪（北京六一生物科技有限公司，型号：DYCP-31E）、凝胶成像系统（上海复日科技有限公司，型号：FR980）、洁净工作台（江苏苏州净化设备厂，型号：SW-CJ-1D）、冷冻高速离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司，型号：JW-2018H）等。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取与检测 取采摘的齿瓣石豆兰样品，用试剂盒提取出其基因DNA。将所得的DNA溶液装入灭菌离心管，用凝胶电泳检测成像，记录结果。

1.3.2 PCR的引物筛选、扩增与检测 参考兰科植物研究文献[5-7]中出现的引物，以及哥伦比亚大学（UBC）公布的100条引物序列，随机选取3个齿瓣石豆兰模板DNA，从中筛选出10条反应体系稳定、扩增条带较清晰、多态性比例较好的引物，最优引物序列见表2。……