黄丽芸 陈小兵

齿瓣石豆兰为兰科石豆兰属植物，分布在江西、广西、福建、广东、浙江等地，文献[1-4]记载具有滋阴降火、清热消肿之功效，可用于急性咽炎、扁桃体炎等，野生品种较少，具有较高的药用价值。本研究以简单重复序列间扩增（ISSR）分子标记技术从遗传多样性方面对其分析研究，探究不同产地齿瓣石豆兰遗传多样性及亲缘关系，为各地齿瓣石豆兰的资源开发提供基础研究数据。

1 材料与方法

1.1 试药

采集江西省赣州市、江西省遂川县、广东省罗浮山等地的野生齿瓣石豆兰，经江西中医药大学国家二级技师颜干明鉴定为齿瓣石豆兰。见表1。

表1 采集信息

1.2 试剂与仪器

试剂：Taq Plus DNA 聚合酶（翌圣生物科技（上海）股份有限公司，批号：10101ES80）、DNA 提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司，批号：DP321-03）、灭菌用水等。

仪器：PCR反应扩增仪（BBI，型号：PCR-96）、凝胶电泳仪（北京六一生物科技有限公司，型号：DYCP-31E）、凝胶成像系统（上海复日科技有限公司，型号：FR980）、洁净工作台（江苏苏州净化设备厂，型号：SW-CJ-1D）、冷冻高速离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司，型号：JW-2018H）等。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取与检测 取采摘的齿瓣石豆兰样品，用试剂盒提取出其基因DNA。将所得的DNA溶液装入灭菌离心管，用凝胶电泳检测成像，记录结果。

1.3.2 PCR的引物筛选、扩增与检测 参考兰科植物研究文献[5-7]中出现的引物，以及哥伦比亚大学（UBC）公布的100条引物序列，随机选取3个齿瓣石豆兰模板DNA，从中筛选出10条反应体系稳定、扩增条带较清晰、多态性比例较好的引物，最优引物序列见表2。实验优化后，最终确定本实验的ISSR-PCR 反应体系为：DNA样品1 μl，引物1 μl，2×Es Taq MasterMix（Dye）10 μl，最后灭菌水加至20 μl。扩增反应程序为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃总延伸1 min，共35个循环；4 ℃保存。最后在2%琼脂糖凝胶、150 V电压下电泳30 min，置于凝胶成像系统上分析成像[8-10]，拍照保存。

表2 最优引物序列

1.3.3 数据处理与分析 根据样品扩增谱带信息，对于不同产地的齿瓣石豆兰DNA样品在琼脂糖凝胶电泳统计时按照有条带为1，无条带为0的原则，用Quantity One软件对图谱上的条带进行标记，导出为0-1矩阵数据[11-13]，通过Popgene v1.32软件进行遗传学分析，得出其遗传特征系数[14-17]，对不同产地齿瓣石豆兰进行遗传一致度与遗传距离分析[18-19]。

2 结果

2.1 ISSR-PCR扩增结果

用筛选出的10个引物对29个齿瓣石豆兰样品进行ISSR-PCR扩增，共扩增出243条清晰的条带，其中多态性条带223条，有效条带数占总条带数91.77%。优选10条引物扩增出的有效条带数范围为8～16条。引物UBC806扩增出的条带最多，为30条；引物UBC819扩增条带最少，为13条。

2.2 齿瓣石豆兰遗传多样性分析

由多态性位点可知，齿瓣石豆兰的遗传变异情况由低到高为FS＜YY＜SC＜LFS＜JLS，变化范围是20.50%～40.18%；由等位基因数（Na）可知，齿瓣石豆兰的遗传变异情况由低到高为FS＜YY＜SC＜LFS＜JLS，变化范围是1.365 6～1.437 4；由有效等位基因数（Ne）可知，齿瓣石豆兰的变异情况由低到高依次为FS＜YY＜SC＜JLS＜LFS，变化范围是1.211 8～1.329 0；由Nei’s基因多样性指数（h）得出，齿瓣石豆兰变异情况由低到高依次是FS＜YY＜SC＜JLS＜LFS，变化范围是0.089 8～0.201 3；依据Shannon’s信息指数（I），齿瓣石豆兰的变异情况由低到高依次是FS＜YY＜SC＜JLS＜LFS，变化范围是0.149 8～0.259 3。见表3。

表3 遗传多样性分析

2.3 遗传距离与遗传一致度

不同产地齿瓣石豆兰之间遗传一致度为0.789 2～0.908 9，遗传距离为0.098 5～0.240 1。见表4。

表4 遗传一致度和遗传距离

2.4 聚类分析

按照地理纬度，本次采集的纬度差异相对较小，聚类分析结果见图1，遗传一致度为0.79～0.90，由聚类分析可知，赣州峰山、赣县杨雅村、龙南九连山、遂川县的亲缘关系较近。

图1 齿瓣石豆兰种群间的聚类分析

3 讨论

本研究利用ISSR方法对江西中南部地区及广东罗浮山地区齿瓣石豆兰进行遗传多样性分析，以其遗传距离进行亲缘关系分析，发现不同产地齿瓣石豆兰之间遗传一致度为0.789 2～0.908 9，遗传距离为0.098 5～0.240 1，表明此地区内齿瓣石豆兰遗传多样性小，亲缘关系较近。

齿瓣石豆兰的遗传多样性与生长的地理位置距离具有一定的关联，本次摘取的齿瓣石豆兰生长地域位置相差不大，其间的遗传多样性较小，所属亲缘关系较近，植物资源的遗传多样性越丰富越有利于新品种选育，资源的亲缘关系越近越有利于植物间育种。本研究首次以分子标记技术为兰科植物齿瓣石豆兰进行遗传多样性分析，对其后期的规范种植及资源开发等提供了科学依据。