付 孟 王 丹,* 何 毅 王 钢 唐艺文 于 明 高 鹏 黄 敏

(1 西南科技大学生命科学与工程学院，四川 绵阳 621010； 2 四川原子能研究院，四川 成都 610101；3 辐照保藏四川省重点实验室，四川 成都 610101)

大黄别名黄良、生军、壮大黄、川军，为蓼科植物掌叶大黄(RheumpalmatumL.)、唐古特大黄(RheumtanguticumMaxim. ex Balf.)或药用大黄(RheumofficinaleBaill.)的干燥根[1]。大黄味苦性寒，是我国一种历史悠久的传统中药材，具有泻下、清热、止血散瘀、保肝利胆、抗菌、抗肿瘤、预防糖尿病等作用[2]。目前，已从大黄中分离得到超过248种成分，主要生物活性成分为蒽醌类，包括芦荟大黄素(aloe-emodin)、大黄酸(rhein)、大黄素(emodin)、大黄酚(chrysophanol)、大黄素甲醚(physcion)等[3]，蒽醌类成分常作为大黄的质量控制指标。此外，还有蒽酮类、二苯乙烯类、苯丁酮类、色原酮类等生物活性成分[4]。大黄的根茎较大，干燥困难，在贮藏过程中容易出现虫害、气味散失、霉变、变色等现象。目前，市售大黄的贮藏加工方式多为晒干、阴干和硫磺熏蒸处理，但晒干和阴干处理效率较低，硫熏会导致药材化学成分改变[5]，且常存在滥熏、过量熏蒸、重复熏蒸等情况。近年来，一些新型处理技术被用于中药材的贮藏保存，但同样存在一定的局限性，例如低温处理技术效率低、过程控制比较困难[6]，远红外贮藏技术仅适用于少量贵重药材的储存[7]，微波处理技术可能会导致某些热敏性成分被破坏[8]。因此，大黄的采后贮藏和加工技术落后成为了限制大黄产业发展的重要因素。

中药由于其独特的生长特性，在采收、干燥、炮制加工及贮藏等环节中易感染微生物，造成药材变质、腐败等问题[9]。辐照技术作为一种绿色、高效的杀菌技术，能最大限度地保持中药材的性状、活性成分含量及药理活性[10]，在中药材贮藏加工方面的应用越来越受到关注。王赵[11]采用60Co-γ射线辐照处理大黄，结果表明辐照对大黄的主要活性成分、指纹图谱均无显著影响。除了60Co可作为辐照源以外，高能电子束辐照在近年来也受到广泛关注。与γ射线辐照相比，高能电子束辐照技术投入成本更低、安全性更强、加工效率更高、射线利用率更高、操作更简单[12]。随着高能电子束辐照技术的不断发展完善，特别是高能电子加速器(10 MeV)的研发和推广[13]，其在各种农产品、副食产品的冷加工、灭菌、贮藏等方面的应用越来越广泛。发布于2015年的《中药辐照灭菌技术指导原则》[14]为高能电子束辐照技术的应用提供了参考和指导。

目前，辐照灭菌技术在大黄中的应用研究报道较少。李月梅等[15]以60Co-γ射线按中药制剂常规剂量(≤10 kGy)辐照大黄饮片，研究大黄饮片中5种成分在辐照前后以及贮藏6个月后的含量变化，结果表明辐照后大黄饮片中芦荟大黄素、大黄素甲醚、大黄素、大黄酚、大黄酸含量均有所下降，贮藏6个月后，虽然大黄饮片中主要成分有所降低，但辐照组大黄饮片中主要成分的稳定性较未辐照组有所增强；陈金月[16]利用薄层层析、紫外吸收光谱等方法研究60Co-γ射线辐照对大黄的影响，结果表明6 kGy以下辐照对大黄主要成分无显著影响；王赵[11]对比了硫磺熏蒸和辐照灭菌对大黄的影响，结果表明辐照对大黄主要成分无显著影响，相对于硫磺熏蒸，辐照灭菌是一种更为安全的方式。但高能电子束辐照技术在大黄饮片的应用研究尚鲜见报道。本研究以川产道地大黄药材为试验材料，利用高能电子束辐照处理，以未处理组和硫磺熏蒸组为对照，综合评估不同高能电子束辐照剂量(2、3、5、7、10、13、15、25 kGy)处理下，大黄中微生物含量、理化性质、活性成分、抗氧化活性的变化，旨在探究适宜大黄的贮藏处理方式，为高能电子束辐照在大黄贮藏加工中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

大黄饮片购自四川省中兴药业有限公司，产于四川阿坝，规格净制(一级)，批号181001，袋装1.0 kg/袋，经西南科技大学侯大斌教授鉴定为掌叶大黄(RheumpalmatumL.)的干燥根茎。

芦荟大黄素(纯度98%)、大黄酸(纯度98%)、大黄素(纯度98%)、大黄酚(纯度98%)、大黄素甲醚(纯度98%)标准品，均购自成都埃法生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、甲醇，色谱纯，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；磷酸、无水乙醇，分析纯，购自成都市科隆化学品有限公司。

1.2 试验仪器

5804R高速离心机，德国Eppendorf公司；GH6000隔水培养箱，天津市泰斯特仪器有限公司；GE60DA高压蒸汽灭菌锅，美国致微公司；DHG-9123A干燥箱，上海申贤恒温设备厂；IS1020高能电子加速器，同方威视科技(北京)有限公司；UltiMate3000DGLC，双三元、二维液相色谱仪系统，美国赛默飞世尔公司；SPECORD 200PLUS紫外-可见分光光度计，德国Analytik Jena公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品辐照处理 大黄饮片采用聚乙烯自封袋(20 cm×30 cm，30丝)封装，每袋约400 g，铺平厚度约4 cm。样品送至四川润祥辐照技术有限公司，采用剂量率约为260 Gy·s-1的高能电子加速器(VF-ProAcc-10/20，10 MeV，20 kW)进行双面辐照处理。设定剂量为2、3、5、7、10、13、15、25 kGy，以未辐照样品(control check, CK)和硫磺熏蒸处理的样品为对照，每组均设置3个重复组。辐照后样品于室温避光贮藏，按《中华人民共和国药典》[1]2020版药材和饮片取样法(通则 0211)分别于辐照后第0、第180、第360天取样检测。

1.3.2 大黄样品微生物数量的测定 大黄饮片需氧菌总数(total aerobic microbial count，TAMC)采用培养基稀释法测定，霉菌和酵母菌总数(total combined yeasts and molds count，TYMC)参照李东娴等[17]的方法按平板涂布法进行检测。TAMC、TYMC含量检测结果以log CFU·g-1表示，大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)参照《GB 4789. 38-2012食品微生物学 检验大肠埃希氏菌计数》[18]进行测定，沙门氏菌(Salmonella)参照《GB 4789. 4-2016食品微生物学检验沙门氏菌检验》[19]进行测定。

1.3.3 大黄样品理化品质的测定 大黄样品粉碎，过二号筛(24目)，按照《中华人民共和国药典》2020版[1]大黄项下规定测定其水分(干燥失重)、总灰分及水溶性浸出物含量。

1.3.4 大黄样品活性成分的测定 大黄5种游离蒽醌类物质含量按《中华人民共和国药典》2020版[1]大黄项下规定的方法测定。

1.3.5 大黄样品抗氧化活性的测定 参照Khanzadi等[20]的方法。检测大黄甲醇提取物中DPPH自由基清除能力。

1.4 数据处理

试验结果均以平均值±标准差(mean ± SD)表示，用SPSS 25进行方差分析，采用Duncan′s 多重比较分析是否有显著差异(P<0.05表示差异显著)，由Origin 2017绘制图形。

2 结果与分析

2.1 高能电子束辐照对大黄贮藏期内微生物数量的影响

《中华人民共和国药典》2020版[1]通则1108中药饮片微生物限度检查法中规定，直接口服及泡服饮片中需氧菌总数不得超过5 log CFU·g-1， 霉菌和酵母菌总数不得超过3 log CFU·g-1。由表1可知，大黄饮片在不同处理及不同贮藏时间内均未检出大肠埃希氏菌和沙门氏菌。贮藏0 d时，CK组大黄微生物数量处于较高水平，TAMC、TYMC数量分别为6.08、5.38 log CFU·g-1，超过药典规定限度。经硫磺熏蒸处理后，微生物数量有所下降，但仍超过现行药典对直接口服及泡服饮片微生物限度的规定。高能电子束辐照处理能降低大黄中微生物的数量，延长大黄的贮藏期。当辐照剂量达到3 kGy及以上时，微生物数量均降至检测限以下，符合现行药典要求。

随着贮藏时间延长，大黄微生物数量总体呈下降趋势，但CK组的微生物数量仍超过药典要求。辐照组大黄微生物数量在贮藏期内变化较小，2 kGy辐照处理的大黄TAMC、TYMC数量变化不明显，3 kGy和5 kGy辐照后贮藏期内检测出少量微生物，而经≥7 kGy剂量辐照处理后贮藏期内未检出微生物。由此可见，当辐照剂量达到3 kGy及以上时，辐照能有效降低大黄中微生物数量，在360 d的贮藏期内微生物数量均控制在药典规定以下。

表1 高能电子束辐照对大黄贮藏期内微生物数量的影响Table 1 Effects of the electron-beam irradiation treatment on microbial loads of Rheum palmatum L. during its storage /(log CFU·g-1)

2.2 高能电子束辐照对大黄贮藏期内理化性质的影响

《中华人民共和国药典》2020版[1]规定，大黄饮片水分不得超过15.00%，总灰分不得超过10.00%。由表2可知，大黄干燥失重约为10.00%，总灰分含量约为5.50%，辐照对干燥失重和总灰分含量均无显著影响。贮藏期内，随贮藏时间延长，大黄干燥失重略有下降，而总灰分含量有所增加，但均符合药典规定。

由表2可知，经高能电子束辐照处理后，大黄水溶性浸出物含量显著增加。贮藏0 d时，CK组大黄水溶性浸出物含量为41.46%，2 kGy辐照时已显著高于CK组。而硫熏处理后，其含量明显降低。随着贮藏期延长，大黄水溶性浸出物含量总体呈下降趋势，但辐照组水浸物含量仍高于对照组和硫熏组。

2.3 高能电子束辐照对大黄贮藏期内活性成分含量的影响

取不同浓度对照品溶液，连续进样考察各对照品浓度与高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)图峰面积的线性关系，得到线性回归方程及线性范围如下：芦荟大黄素Y= 0.943 2X- 0.05 (R2= 0.999 9 )，1.578 ～ 15.78 μg·mL-1；大黄酸Y= 0.830 1X- 0.103 6 (R2= 0.999 7)，1.584 ～ 15.84 μg·mL-1；大黄素Y= 0.672 7X- 0.010 9 (R2= 0.999 9)，1.584 ～ 15.84 μg·mL-1；大黄酚Y= 1.107 9X- 0.014 5 (R2= 0.999 9)，1.606 ～ 16.06 μg·mL-1；大黄素甲醚Y= 0.811 4X+ 0.122 8 (R2= 0.999 6)，0.782 ～ 7.82 μg·mL-1。由图1可知，5种蒽醌类化合物色谱峰分离较好，峰内无杂质干扰，在各自的线性范围内线性关系良好。

表2 高能电子束辐照对大黄贮藏期内理化性质的影响Table 2 Effects of the electron-beam irradiation treatment on physicochemical properties of Rheum palmatum L. during its storage

注：A：对照品；B：样品；1：芦荟大黄素；2：大黄酸；3：大黄素；4：大黄酚；5：大黄素甲醚。Note: A: Standards. B: Sample. 1: Aloe-emodin. 2: Rhein. 3: Emodin. 4: Chrysophanol. 5: Physcion.图1 大黄HPLC图Fig.1 HPLC chromatogram of Rheum palmatum L.

蒽醌类化合物为大黄药效的主要成分之一。由图2-A可知，经高能电子束辐照后，大黄蒽醌类成分含量略有上升，主要体现在大黄酚含量增加，而对其他成分影响不大。随辐照剂量增加，大黄酚含量先升高后趋于平稳，当辐照剂量达到25 kGy时，其含量呈下降趋势。其他4种蒽醌类成分经15 kGy及以下剂量辐照后，其含量变化不明显，在25 kGy时，也表现出下降趋势。

由图2-B可知，经360 d贮藏后，大黄蒽醌类成分整体明显下降。辐照处理的大黄蒽醌类成分含量高于CK组，且总体上随辐照剂量增加而略有上升，而硫熏处理组大黄蒽醌类成分含量略低于CK组和辐照组。由此可见，大黄蒽醌类成分含量随贮藏时间延长明显下降，高能电子束辐照处理有利于保持大黄贮藏期内主要活性成分含量。

注：A：贮藏第0天；B：贮藏第360天。Note: A:Storage day 0. B:Storage day 360.图2 高能电子束辐照对大黄贮藏期内蒽醌类成分含量的影响Fig.2 Effects of the electron-beam irradiation treatment on the anthraquinones of Rheum palmatum L. during its storage

2.4 高能电子束辐照对大黄抗氧化活性的影响

由图3可知，不同剂量辐照和硫熏处理对大黄DPPH自由基清除率无显著影响(P>0.05)，且贮藏期内，其DPPH自由基清除率无明显变化。表明高能电子束辐照及贮藏时间对大黄抗氧化活性影响不大。

图3 高能电子束辐照对大黄贮藏期内DPPH自由基清除活性的影响Fig.3 Effects of the electron-beam irradiation treatment on the DPPH of Rheum palmatum L. during its storage

3 讨论

3.1 高能电子束辐照对大黄贮藏过程中微生物数量的影响

本研究中，高能电子束辐照能降低大黄中微生物数量，当辐照剂量达到3 kGy及以上时，微生物数量均降至检测限度以下，达到现行药典要求。随贮藏时间的延长，大黄中微生物数量略有下降，其原因可能与贮藏过程中干燥的环境以及药材自身的理化性质有关[21]。李奉勤等[22]利用60Co-γ射线辐照三黄片中大黄粉，结果显示适宜辐照剂量为2 kGy；白羽辛等[23]对人参粉进行辐照处理，结果发现达到预期灭菌效果的辐照剂量为6 kGy。与本试验结果有所不同，其原因可能是初始微生物负载不同。蔡汶莉[24]用电子束辐照百合和山银花药材，结果表明两种药材的初始含菌值不同，相同辐照剂量下的灭菌效果不同，表明适宜的辐照剂量不同。Khawory等[25]研究也表明，爪叶洋茱萸、灌状买麻藤、非洲楝的适宜辐照剂量为9～13 kGy，而其叶提取物的适宜辐照剂量为6～12 kGy。表明样品初始微生物负载越高，其适宜的杀菌剂量越大。

3.2 高能电子束辐照对大黄理化品质的影响

中药饮片浸出物是衡量中药优劣的重要指标。王宁宁[26]研究表明，以水溶性浸出物作为评判山药饮片质量等级的主要指标是可靠的。王薛等[27]也将水溶性浸出物作为评价藏边大黄质量的标准之一。在《中华人民共和国药典》[28]中收录的以大黄为主要成分的水煎剂多达28种，可见大黄水浸物含量是评价大黄质量的一项重要指标。本研究中大黄饮片经不同剂量电子束辐照处理后，大黄水溶性浸出物显著增加，增幅与辐照剂量总体呈正相关。蔡汶莉[22]报道了电子束辐照后百合药材水溶性浸出物含量显著增加，与本研究结果一致。其原因可能是辐照后蛋白质等大分子发生降解，产生如糖类化合物、有机酸、游离氨基酸等。随着贮藏时间延长，大黄水溶性浸出物含量呈现下降趋势，但辐照组的浸出物含量仍显著高于对照组。李倩等[29]研究表明，大黄浸出物含量随贮藏时间的延长有所降低，质量呈下降趋势，与本研究结果一致。本研究中，电子束辐照后大黄水溶性浸出物含量显著高于对照组及硫熏处理组，且对其干燥失重、总灰分含量无明显影响，表明电子束辐照有利于保持贮藏期内大黄的品质，其效果明显优于硫熏处理。

3.3 高能电子束辐照对大黄活性成分含量的影响

大黄蒽醌类化合物具有泻下利尿、抗菌、抗病等多种作用，是药典规定的大黄质量控制指标之一。本研究表明，电子束辐照后，蒽醌类化合物含量略有增加。王赵[11]采用60Co-γ射线和正电子辐照大黄，结果表明25 kGy以下剂量γ射线辐照对大黄蒽醌类成分无显著影响，且两种射线辐照对大黄指纹图谱均无明显影响。毛滕霄等[30]研究发现，30 kGy剂量以下60Co-γ射线辐照后，大黄总蒽醌、游离蒽醌含量无明显变化。李月梅等[15]研究表明，大黄饮片中大黄素含量最高，经60Co-γ射线辐照后大黄饮片蒽醌类含量均有所下降，其中大黄素甲醚含量降幅最大，与本研究结果存在差异，原因在于不同产地大黄主要成分含量差异较大[31]。有研究表明，大黄中主要活性成分的含量与贮藏时间有关[32-33]。本研究中，贮藏第0天时，大黄蒽醌类成分随着辐照剂量的增加，呈现先上升后下降的趋势，可能是辐照促进大黄内蒽酮、蒽酚转化为蒽醌，导致蒽醌类成分含量上升[29]。而蒽醌类成分易分解，且受温度的影响较大[34]，随着贮藏时间的增加，大黄活性成分含量降低。唐文文[35]研究发现，大黄在贮藏期内活性成分含量有所降低，可能是因为贮藏过程中的质量耗损，与本研究结果一致。本研究采用高能电子束对大黄饮片进行不同剂量辐照处理，结果表明高能电子束辐照在一定程度上能提高大黄中主要活性成分含量，且增加其贮藏过程中主要成分的稳定性，说明高能电子束辐照处理对大黄的贮藏具有积极作用。

3.4 高能电子束辐照对大黄抗氧化活性的影响

现代药理研究表明，大黄主要对消化系统、保肝、肾脏等具有保护作用，还具有抗氧化、改善微循环等作用[36]。大黄所含的蒽醌类衍生物和鞣质等能对自由基引起的细胞损伤起到直接作用，有利于细胞抗衰老及机体修复，此外，大黄的抗氧化活性对于大黄的其他药用成分发挥作用起着较强的辅助作用。因此，大黄的抗氧化活性是评价大黄品质的一个重要指标[37]。

王宇卿等[38]利用高效液相色谱-质谱仪(high performance liquid chromatography mass spectrometer, HPLC-MS)联用检测装置分析大黄中抗氧化活性成分，在某种程度上客观地评价了大黄的质量。Serhat等[39]报道了大黄提取物是良好的抗氧化剂，对DPPH自由基清除率、羟自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率均高于抗氧化剂叔丁基羟基茴香醚(butyl hydroxy anisd,BHA)。袁诗俊等[37]研究表明，大黄60%乙醇提取物的DPPH自由基清除率最高，为96.02%。以上研究均表明，大黄具有良好的抗氧化活性，除传统药用外，在保健食品的开发研究方面也有广阔的应用前景。

本研究表明，25 kGy及以下剂量电子束辐照、硫熏处理和贮藏时间对大黄DPPH自由基清除率均无明显影响。吕慧英等[40]研究表明，大黄酚、大黄素甲醚与DPPH自由基清除能力呈负相关，而与大黄酸、芦荟大黄素、大黄素DPPH自由基清除能力呈正相关。本研究仅探究了蒽醌类物质在贮藏期内的变化，5种成分含量在贮藏期内的变化可能导致大黄的抗氧化活性变化不显著。且大黄的抗氧化活性不仅与蒽醌类成分相关，而且是大黄内所有抗氧化性物质共同作用的结果[41]，大黄内的鞣质类化合物和苷类化合物也会影响大黄的抗氧化活性，因此大黄抗氧化活性变化不显著也可能是鞣质类化合物与苷类化合物的影响。何毅等[42]采用2、4、6 kGy高能电子束辐照川麦冬，结果表明高能电子束辐照对川麦冬抗氧化活性无显著影响，与本研究结果类似。徐远芳等[43]采用60Co-γ射线和电子束辐照对葛根提取物的研究也得到了类似的结果，即两种射线辐照对葛根提取物的DPPH自由基清除率、羟自由基清除率及总还原力均无显著影响。张玉等[44]采用1、2、3 kGy电子束辐照香菇，结果表明辐照对香菇DPPH自由基清除率无显著影响。孙熙浛等[45]研究表明，5、10、30 kGy辐照剂量对红景天提取物的DPPH自由基清除率、2，2′-联氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐[2,2′-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid ammonium salt),ABTS]自由基清除率影响不大，与对照组相比均无显著差异，与本试验结果类似。在此研究基础上，今后拟探究电子束辐照加工工艺，以期提高辐照加工效率，为电子束辐照在大黄上的应用提供依据。

4 结论

本研究结果表明，相比硫磺熏蒸，电子束辐照能有效延长大黄的贮藏期，且对大黄品质影响不大。当电子束辐照剂量达到3 kGy时能有效杀灭大黄中的微生物，辐照范围在3～5 kGy时，微生物限度达到《中华人民共和国药典》现行标准以下，同时大黄水浸物含量明显增加，活性成分含量略有增加，适用于辐照后短期(约180 d)贮藏。当辐照剂量达到7 kGy时大黄中的需氧菌、霉菌和酵母在贮藏期内未检出，7～10 kGy辐照处理能使微生物含量在一年的贮藏期内处于较低水平，且对其活性成分含量具有较好的保持作用，适用于辐照后长期(约360 d)贮藏。