杨晓蓉 杨启梅 韩想利 张文

1 陕西省人民医院耳鼻咽喉头颈外科(西安 710068)

梅尼埃病是临床常见的耳科疾病，临床多表现为发作性眩晕、耳鸣、耳胀满感及感音神经性听力下降等，其病因及发病机制尚不明确，认为与内淋巴管机械性阻塞、内淋巴吸收障碍、内耳缺血、免疫反应、遗传因素及感染等有关[1]。研究发现免疫反应学说与梅尼埃病发病关系密切，内淋巴囊中免疫球蛋白和淋巴细胞参与内淋巴液的吸收，是内耳免疫反应的部位[2]。有研究报道，内耳可以介导局部免疫炎性反应，梅尼埃病患者自身存在免疫紊乱，免疫因素与梅尼埃病发生发展关系密切[3，4]。梅尼埃病患者存在局部及全身免疫反应，对糖皮质激素免疫抑制治疗有效，提示其发病机制与免疫因素有关[5]。CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)具有免疫抑制功能，在维持细胞免疫耐受方面具有重要作用。研究发现，Treg细胞能够抑制T淋巴细胞和B淋巴细胞的免疫应答，抑制抗体介导的免疫反应，在自身免疫性疾病的发生中发挥重要作用；Treg细胞功能障碍或数量减少时，机体免疫耐受抑制，免疫功能紊乱，引发一系列免疫反应，进而损害自身组织、器官及细胞，引发自身免疫性疾病[6]。张菊红等[7]研究表明，CD4+CD25+Treg细胞抑制功能下降与自身免疫性感音神经性聋发病关系密切，其功能或数量变化与自身免疫性内耳疾病小鼠病情严重程度呈正相关。Treg作为免疫学研究的重点近年在慢性炎症及自身免疫疾病的治疗中提供了重要指导。基于梅尼埃病的免疫学病机及Treg细胞可介导免疫耐受，推测Treg在梅尼埃病的发病中有重要作用，故本研究通过观察CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞及其相关因子在梅尼埃病患者外周血中的表达，探讨其在梅尼埃病发生中的临床意义。

1 资料与方法

1.1研究对象及分组 纳入2019年8月至2021年5月收治的45例梅尼埃病患者作为研究组，以同期健康人群30例作为对照组。研究组中男7例，女28例，年龄32～68岁，平均44.7±6.9岁；其中缓解期13例，发作期32例；单侧36例，双侧9例；听力分期1期3例，2期20例，3期16例，4期6例。健康对照组中男12例，女18例，年龄34～69岁，平均45.2±5.8岁。两组性别、年龄等差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究获得医学伦理委员会批准，患者及家属均知情同意。

梅尼埃病组纳入标准：梅尼埃病诊断参考《梅尼埃病诊断和治疗指南(2017)》[8]；无耳蜗和前庭相关其他疾病；排除其他原因引起的眩晕；近期未使用免疫制剂、糖皮质激素、抗组胺药物等；无其他重大疾病等；以患者最近6月内间歇期听力最差时0.5、1.0、2.0 kHz纯音平均听阈进行分期，一期:平均听阈≤25 dB HL，二期:平均听阈为26～40 dB HL，三期:平均听阈为41～70 dB HL，四期:平均听阈>70 dB HL。健康对照组患者无耳鼻疾病，常规体检及专科查体均正常。

1.2外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞检测 采集两组对象晨起空腹外周静脉血约5 ml，抗凝管中低温保存；取新鲜抗凝全血100 μL，梯度离心法分离外周血中单个核细胞(PBMCs)，加入FITC-CD4抗体、PE-CD25抗体各20 μL，混匀避光反应10 min，2 000 r/min离心10 min，弃上清，固定穿孔，加入APC-FOXp3抗体标记，多聚甲醛固定，利用流式细胞仪以CD4设门，用CD4+CD25+和Foxp3+标记Treg细胞亚群，检测CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞占CD4+T细胞的百分比。

1.3外周血PBMCs中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞相关因子转化生长因子-β(TGF-β)、叉头状转录因子p3(Foxp3)mRNA相对表达检测 采用Trizol法提取单个核细胞总RNA，检测样品浓度，通过逆转录试剂盒逆转录为cDNA，以此为模板配置PCR反应体系行PCR扩增反应，反应条件为：95 ℃ 15 s，：61 ℃ 15 s，72 ℃ 40 s，循环40次，采用2-△△CT法分析TGF-β、Foxp3 mRNA相对表达。引物序列如下：TGF-β上游：5′-TGAAGCACGGAC-AGCCAGACG-3′，下游：5′-CTGCTAGCCAGTCA-GCCGAAT-3′；Foxp3上游：5′-AAGACAGGCCA-TCGGCCAGAAC-3′，下游：5′-TCCACGTGATCG-AGCGGTCGAC-3′；GAPDH上游：5′-GCACGGTGAACGCTCAGAAC-3′，下游：5′-TGCTGAACA-GCCGAGTCGA-3′。

1.4血清IL-10水平检测 采用促凝真空采血管采集两组晨起空腹外周静脉血约3 ml，待其自然凝固后3 600 r/min离心15 min，收集血清低温保存；采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清白细胞介素-10(interleukin-10, IL-10)水平，检测按操作说明书严格进行，检测试剂盒购自北京达科为生物科技有限公司。

2 结果

2.1两组CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞百分比及相关因子水平比较 由表1可见，梅尼埃病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞百分比、外周血Foxp3 mRNA相对表达及血清IL-10水平明显低于健康对照组，外周血TGF-β mRNA相对表达量则明显高于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。健康对照组CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞百分比及Foxp3 mRNA、血清IL-10水平高于梅尼埃病缓解期组，缓解期组高于发作期组，差异有统计学意义(P<0.05)(表1)；健康对照组TGF-β mRNA水平低于梅尼埃病缓解期组，缓解期组低于发作期组(P<0.05)。

表1 两组CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞百分比及相关因子水平比较

2.2外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞百分比及相关因子水平与梅尼埃病患者不同听力分期和单双侧患耳的关系 梅尼埃病单、双侧患者及不同听力分期患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞百分比、血清IL-10及外周血TGF-β、Foxp3 mRNA水平组间差异均无统计学意义(P>0.05)(表2、3)。

表2 单、双侧梅尼埃病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞百分比及相关因子水平比较

2.3梅尼埃病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞百分比与TGF-β、Foxp3、IL-10表达的相关性 Pearson相关性分析显示，梅尼埃病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞百分比与外周血TGF-βmRNA水平呈负相关(r=-0.704，P<0.05)，与血清IL-10水平(r=0.679，P<0.05)和外周血Foxp3 mRNA水平(r=0.725，P<0.05)呈正相关。

表3 不同听力分期梅尼埃病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞百分比及相关因子水平比较

3 讨论

T淋巴细胞参与的细胞免疫和浆细胞介导的体液免疫是免疫反应的两种，正常情况下，免疫系统能够协调阻止免疫细胞对自身分子及组织、细胞产生免疫反应；当Treg细胞功能障碍时，机体免疫系统紊乱，机体自动识别抗原，引起一系列免疫反应，促进慢性炎症及自身免疫性疾病的发生[6,9]。Treg细胞在维持机体稳态中具有重要作用，是免疫耐受的关键，相比于正常人群，自身免疫性疾病患者发病期Treg细胞水平降低，免疫抑制减轻，机体呈现高免疫反应状态；随着疾病缓解，Treg细胞水平升高，机体免疫抑制功能增强，免疫反应减弱[10]。而在自身免疫性内耳疾病的研究中发现，Treg细胞参与该病的病机为激活的T细胞穿过血脑屏障进入脑实质，经局部抗原的再次刺激能够分泌大量细胞因子和趋化因子，招募外周循环中的T细胞、B细胞及单核细胞进入内耳，扩大免疫反应，损伤内耳组织[7]。CD4+CD25+Treg细胞通过抑制过强的自身免疫反应可对自身免疫性内耳疾病大鼠产生保护作用[7]。CD4+CD25+Treg细胞能抑制调控免疫反应，维持机体免疫耐受和免疫平衡，在防止变应性疾病、自身免疫疾病及母胎免疫耐受中发挥关键作用[11～13]。基于梅尼埃病免疫反应学说，内耳能够接受抗原刺激产生免疫应答以及Treg细胞介导参与自身免疫性疾病的发展，本研究探讨了CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞与梅尼埃病发生的关系，结果显示梅尼埃病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞占CD4+T细胞的百分比明显降低，表明梅尼埃病患者免疫抑制减弱。

CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞在体内主要通过TGF-β、IL-10等抑制性细胞因子发挥作用。TGF-β是诱导外周血CD4+T细胞向Treg细胞转化的关键，其能抑制免疫活性细胞增殖、抑制细胞因子产生、抑制淋巴细胞分化，是切断免疫应答的信号之一[14]。Treg细胞数量减少，机体代偿机制促进TGF-β分泌以调节Treg细胞数量，增强免疫抑制功能[15]；IL-10是重要的抗炎因子，主要由Foxp3+Treg细胞分泌，能够抑制辅助性T细胞(Th细胞)介导的免疫病理学反应，维持组织稳态[16]。Treg细胞不同群体及其分泌的IL-10在维持免疫耐受方面具有重要意义，可提示疾病转归[17]。腺病毒介导的IL-10因子转导入豚鼠内耳并表达基因产物，可在一定程度上减轻内耳组织免疫炎性损伤和听力损伤[18]。此外，Foxp3是Treg细胞重要的调控基因，也是其重要的特异性标志，对Treg细胞的生成及功能维持起着重要作用[19]。本研究检测梅尼埃病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞相关因子发现，TGF-βmRNA相对表达明显升高，Foxp3 mRNA和血清IL-10水平明显降低；健康对照组CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞百分比及相关因子表达优于梅尼埃病缓解期，缓解期优于发作期，且CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞百分比与TGF-β、Foxp3、IL-10表达存在明显的相关性，表明梅尼埃病患者处于免疫增强状态，提示Treg细胞介导的细胞免疫调节与梅尼埃病的发生发展关系密切。另外，本研究还发现外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例及相关因子水平在不同听力分期和单双侧梅尼埃病患者中无明显差异，表明梅尼埃病患者Treg细胞稳定表达，印证了其本身即存在免疫抑制，可将Treg细胞及其相关因子作为梅尼埃病免疫检测的预测指标。

综上所述，梅尼埃病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞及相关细胞因子TGF-β、Foxp3、IL-10异常表达，且与病情进展程度关系密切，可能与患者体内免疫抑制减弱有关。由Treg细胞调控的细胞免疫异常可能是梅尼埃病的发病机制之一，然目前关于CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞及其相关因子与梅尼埃病的研究报道较少，其参与调控的机制还需后期进一步的继续探究分析。