鲁 杰， 周义霞， 刘 叶， 高 雅， 陈科璇， 李顶春， 陈一晖， 刘怀鄂， 王宏图， 李 武

昆明医科大学第一附属医院 感染与肝病科， 昆明 650032

整合素参与了细胞的存活、增殖、黏附、迁移、侵袭等功能，调节血管生成、肿瘤生长、细胞外基质(extracellularmatrix, ECM)的降解[1-2]，在多种疾病中上调，且与肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化有着重要关联[3-5]，在肝癌、肝纤维化、乙型肝炎、丙型肝炎及非酒精性脂肪性肝病等慢性肝病中的相关研究也越来越多。整合素α4(integrin α4, ITGA4)也称CD49d，作为黏附受体是细胞骨架动力学和细胞迁移的重要调节因子，主要在T淋巴细、B淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞、嗜酸细胞、嗜碱细胞、NK细胞、肥大细胞和树突状细胞上表达。炎症反应和免疫失调是导致肝纤维化的主要病理机制。ITGA4激活后可促进淋巴细胞、单核细胞等白细胞向黏膜、骨髓、脾脏、肝脏等炎症部位迁移，因此参与了肝纤维化中的炎症反应、适应性免疫和固有免疫的每一步[6]，在肝纤维化的发生机制中具有不可替代的作用。黏糖氨酸(aticky sugar amino acid, SSAA)是利用现代工艺从美洲大蠊中提取的以黏糖氨酸为主要有效成分的制剂，具有抗菌、抗肿瘤、营养肌肉神经、保肝、抗纤维化作用。为此，本文以SSAA的抗肝纤维化作用为基础，CCl4诱导大鼠肝纤维化造模，设定不同的SSAA干预浓度，研究ITGA4等细胞因子在肝纤维化中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 美洲大蠊提取物SSAA，昆明赛诺制药有限公司提供，系肝龙胶囊原药(批准文号：国药准字Z2005113；执行标准：YBZ04142005)。以每150 mg SSAA固体溶于15 mL生理盐水，配置成10 mg/mL的SSAA的混悬液；CCl4与橄榄油溶液以V∶V=3∶7配制成30%的CCl4/橄榄油溶液。以1 g秋水仙碱溶于5 mL的磷酸盐缓冲盐溶液(phosphate buffered saline, PBS)配制成200 mg/mL的秋水仙碱溶液，摇匀后再取0.1 mL溶于100 mL PBS中，配制成0.2 mg/mL的秋水仙碱溶液，冰箱保存备用。健康SPF级SD大鼠80只，雄性，体质量180～220 g，由昆明医科大学实验动物学部提供。动物生产许可证号: SCXK(滇)K2020-0004。实验过程中饲养条件相同，定期清洁、消毒。

1.2 试剂 秋水仙碱购自上海源叶生物科技有限公司；CCl4购自天津化学试剂三厂；橄榄油购自Alladdin公司；肝纤四项酶联免疫检测试剂盒均购自南京建成公司；总RNA提取试剂Trizol购自Thermofisher公司；RNA逆转录合成cDNA试剂盒购自Thermofisher公司；PCR试剂盒购自Roche公司；PCR引物由昆明硕擎生物技术有限公司合成；ITGA4、ITGB1、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体购自Cell Signaling公司；TGFβ1抗体购自Proteintech公司；基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)2、TIMP1抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司；β-actin抗体购自Proteintech公司；苏木素-伊红(HE)染色液购自Solarbio公司。

1.3 方法 将80只大鼠随机分为7组，空白对照组(n=10)、SSAA组(n=10)、CCl4模型组(n=12)、秋水仙碱组(n=12)、SSAA低剂量组(n=12)、SSAA中剂量组(n=12)、SSAA高剂量组(n=12)。空白对照组和SSAA组分别以蒸馏水与配置的10 mg/mL的SSAA溶液按大鼠体质量120 mg/kg灌胃。CCl4模型组、秋水仙碱组及SSAA低、中、高剂量组以30%的CCl4/橄榄油溶液1 mL/kg腹腔注射，2次/周，连续12周造模，同时秋水仙碱组以0.2 mg/mL的秋水仙碱溶液按大鼠体质量0.2 mg/kg灌胃，1 次/d；SSAA低、中、高剂量组以配置的10 mg/mL的SSAA溶液分别按大鼠体质量以30 mg/kg、60 mg/kg、120 mg/kg灌胃[7]，2次/d。末次灌胃后，予所有大鼠禁食24 h，不禁水。取样前，先予大鼠乙醚吸入麻醉，眼眶处采血，然后取肝左中部及右上叶前部标本，行血液、肝组织标本检测。

1.4 检测指标

1.4.1 血清ALT、AST检测 大鼠眼眶取血，采用全自动生化检测仪检测血清ALT、AST，步骤严格按照说明书执行。

1.4.2 肝组织病理染色 选取肝右叶，取0.5 cm×0.4 cm×0.4 cm肝组织，将肝组织固定在4%多聚甲醛中，脱水、透明、浸蜡后包埋在石蜡中并切片成4 μm厚的连续切片，脱蜡、水化后行HE染色、天狼猩红染色。

1.4.3 免疫组化染色 将肝组织于室温下固定在4%多聚甲醛中，常规制备石蜡切片，石蜡切片脱蜡至水化、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、血清封闭等步骤后，加第一抗体4 ℃孵育过夜；加第二抗体37 ℃孵育1 h，加新鲜配置的DAB显色液显色后，复染细胞核、脱水封片，显微镜下观察、拍照，棕褐色为阳性。

1.4.4 实时荧光定量PCR检测大鼠肝组织各因子转录水平的表达 Trizol分离提取肝组织中总RNA，将RNA逆转录为cDNA，严格按试剂盒说明操作，通过目的基因定量拷贝数=2-△△CT方法分析数据。基因引物序列见表1。

表1 PCR引物Table 1 PCR primer

1.4.5 大鼠肝组织Western Blot检测 实验12周结束后提取大鼠肝组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，Western Blot测定肝组织ITGA4、ITGB1、α-SMA、TGFβ1、TIMP2、TIMP1蛋白水平，β-actin作为内参。

2 结果

2.1 各组ALT、AST水平比较 CCl4模型组中的ALT、AST水平与各组相比均显著升高；秋水仙碱或SSAA干预后能显著降低ALT、AST水平，以SSAA高剂量组降低转氨酶效果最显著(P值均<0.05)(表2)。

表2 各组ALT、AST水平Table 2 Transaminase levels in each group

2.2 各组HE染色结果 空白对照组和SSAA组HE染色结果显示有相对完整的肝组织结构及正常的肝细胞形态，肝细胞索从中央静脉呈放射状排列，而CCl4模型组中大量炎症细胞浸润、肝细胞水肿变性和肝小叶结构破坏，秋水仙碱或SSAA低、中、高剂量干预后肝小叶结构较CCl4模型组改善，少见炎性细胞浸润及肝细胞水肿，并且SSAA高剂量组对抑制肝细胞炎症和保护肝小叶结构效果最显著(图1)。

图1 各组HE染色结果(×200)

2.3 各组天狼猩红染色结果 空白对照组和SSAA组的天狼猩红染色结果显示未见明显胶原沉积，CCl4模型组中肝细胞水肿变性、大量胶原沉积导致肝小叶结构紊乱，秋水仙碱或SSAA低、中、高剂量干预后胶原沉积较CCl4模型组减少，以SSAA高剂量组抑制胶原生成的效果最显著(图2)。

2.4 各组肝纤维化相关因子转录水平比较 CCl4模型组中的ITGA4、TGFβ1、α-SMA、TIMP2转录水平均显著高于其他组(P值均<0.05)，秋水仙碱或SSAA干预后能降低各因子转录水平。在ITGA4、ITGB1、TGFβ1和TIMP2转录中，SSAA低剂量组抑制效果最显著；在α-SMA转录中，SSAA高剂量组抑制效果最显著，但各因子转录水平在SSAA低、中、高剂量组间差异无统计学意义(P值均>0.05)(图3)。

2.5 各组中肝纤维化相关因子蛋白表达结果 CCl4模型组中的ITGA4、TGFβ1、α-SMA、TIMP1和TIMP2蛋白表达高于其他组，MMP2蛋白表达低于其他组，在秋水仙碱或SSAA干预后均能抑制ITGA4、TGFβ1、α-SMA、TIMP1、TIMP2表达，促进MMP2表达，且以SSAA高剂量组效果最明显；而在ITGB1的蛋白表达中，各组未见明显表达差异(图4)。

2.6 各组中TGFβ1、α-SMA的免疫组化结果 CCl4模型组的TGFβ1、α-SMA的表达显著高于其他组。秋水仙碱或SSAA干预后均能抑制表达，且以高剂量SSAA组改善效果最明显(图5、6)。

图2 各组天狼猩红染色结果(×200)Figure 2 Sirius red staining in each group(×200)

注：与空白对照组相比，#P<0.05；与SSAA组相比，△P<0.05；与CCl4模型组相比，＊P<0.05。

图4 各组相关因子的蛋白表达情况

图5 各组中TGFβ1的免疫组化结果(×200)

图6 各组中α-SMA的免疫组化结果(×200)

3 讨论

细胞迁移对发育、伤口愈合和免疫反应等都是必不可少的过程。当肝细胞暴露于损伤应激时，会启动病原相关分子模式和损伤相关分子模式，触发一系列的炎症反应通路，释放细胞因子、趋化因子入血，募集循环中的单核细胞、中性粒细胞迁移至肝脏[8]。此外，肝内肝实质细胞、Kupffer细胞、胆管上皮细胞等产生大量的TGFβ1和分泌其他的炎症介质，促进Kupffer细胞调节HSC转化为成纤维细胞，获得收缩、促炎和纤维化特性[9]。活化的HSC表达α-SMA，产生过量ECM[10]。HSC分泌的ECM(主要是胶原蛋白)积累会扭曲正常的肝脏结构并形成纤维疤痕，随着胶原沉积的增加，再生的肝细胞形成结节会进一步导致肝硬化。胶原蛋白主要受MMP和TIMP组成的MMP/TIMP系统调节。整合素是一组细胞表面受体，在外介导细胞与ECM的结合，在内介导信号通路来启动或抑制细胞运动。整合素也可促进TGFβ1活化，促进组织纤维化的发生，包括皮肤瘢痕形成、肝脏纤维化、肾脏纤维化、软骨纤维化、心肌纤维化、肺纤维等[11-14]。

本研究以CCl4诱导大鼠肝纤维化造模，给药12周后HE染色见肝小叶结构紊乱、丧失，炎细胞浸润，肝细胞水肿、变性、坏死；天蓝猩红染色示胶原蛋白增多，造模成功。秋水仙碱或SSAA药物干预后能降低肝脏的转氨酶，抑制肝脏炎症，减少胶原蛋白的生成，显著改善肝小叶结构，证明秋水仙碱或SSAA具有抗肝纤维化及保护肝细胞的作用，其中以高剂量(120 mg/kg)的SSAA组效果最明显。虽然实验证明秋水仙碱有一定的抗肝纤维化作用，但其副作用大，基本不用于临床治疗，只作为实验的对照组。本实验在肝纤维化的相关细胞因子检测中发现，与CCl4模型组相比，SSAA干预后能抑制TGFβ1、α-SMA表达，调节MMP/TIMP系统，减少细胞基质生成，重要的是ITGA4在不同程度的肝纤维化中差异性表达，有显著的差异趋势，与促肝纤维化的相关因子TGFβ1、α-SMA的表达升高一致，明确了ITGA4参了肝纤维化的发生和发展。

整合素是由18个α亚基和8个β亚基非共价结合成24种不同的异质二聚体，在组织中的表达具有特异性，是一种重要的黏附受体。每个整合素异二聚体由一个大的胞外域，一个跨膜域和一个短的胞质尾构成，胞外区为氨基末端，胞内区为羧基末端。整合素在动、植物细胞中广泛表达，受到刺激时会发生构象改变，并增加与配体的亲和力。细胞接头蛋白识别整合素上短的氨基酸序列，感知ECM后诱导自身构象变化，增加对细胞外基质配体的亲和力，将信号从ECM传递到细胞内部，同时胞内与肌动蛋白细胞骨架结合，招募更多的细胞内信号传导，启动各种下游信号通路[15]。整合素是细胞对ECM环境反应的重要介质，能够对局部组织成分变化作出快速反应。

ITGA4亚基是整合素家族中研究最少的整合素之一，在细胞迁移方面备受关注，以往的研究重点是介导炎症性疾病中的T淋巴细胞的迁移。人源化的抗ITGA4的单克隆抗体——那他珠单抗已被证明可以减少炎症性疾病中T淋巴细胞的迁移，临床上多用于治疗多发性硬化症和克罗恩病，但在抗肝纤维化机制研究中的作用知之甚少。与前面讨论的经典整合素不同，ITGA4不需要接头蛋白将整合素连接到细胞骨架，可直接与黏附蛋白特异性结合触发黏着斑激酶磷酸化，从而促进迁移[16]。体内实验[17]已表明，在药理上抑制ITGA4可防止白细胞在炎症部位聚集。ITGA4主要与整合素β1、β7亚基结合，主要配体是炎症中的小静脉内皮上被诱导的血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1)、黏膜地址素细胞黏附分子-1(mucosal adhesion-cell adhesion molecule-1, MAdCAM-1)和纤粘连蛋白，但都不是同时结合。VCAM-1介导细胞迁移于外周组织，MAdCAM-1介导细胞迁移于肠道组织[18]。研究[19]报道，阻断α4β7减少了α4β7+CD4 T淋巴细胞的肠道和肝脏募集，显著减少了小鼠的黏膜炎症、肝脏炎症和纤维化，而且改善了非酒精性脂肪性肝炎相关的代谢紊乱。

在本实验中未发现ITGB1蛋白表达在肝纤维化中有显著差异，后期仍需进一步明确ITGB1、ITGB7是否参与肝纤维化的发生及进行更深入的机制研究。综上所述，本研究明确了ITGA4参与了肝纤维化的发生，不管是在肝脏炎症反应还是免疫机制的作用上，这是一个新的抗肝纤维化机制突破口。

伦理学声明：本研究方案于2021年2月26日由昆明医科大学动物伦理委员会审批通过，批号：2021-206，符合实验室动物管理与使用准则。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：鲁杰负责课题设计，资料分析，撰写论文；周义霞、高雅、陈科璇参与实验设计；李顶春、刘叶、陈一晖拟定写作思路；刘怀鄂、王宏图修改论文；李武指导撰写论文并最后定稿。