田文曲，郭娜，任新玲，马冰馨，姚青云，李倪捷，李钰莹

(华中科技大学同济医学院附属同济医院生殖中心，武汉 430000)

近年来，随着人口老龄化、不良生活方式、环境恶化、工作压力等多重因素的加剧，男性不育患者的数量逐年上升，男性因素引起的不育占不孕症的40%左右[1]。尽管卵胞浆内单精子注射技术(ICSI)在治疗男性不育方面具有较好的临床效果，但ICSI技术带来的医源性子代安全问题亟需引起人们关注。辅助生殖技术(ART)的首要目标是选择具有高发育潜力的胚胎，实现单胎健康活产。第三天(D3)新鲜卵裂期胚胎移植是目前许多生殖中心常用的移植策略，通常根据标准化的评分细则比如卵裂球的数量、碎片化程度、卵裂球的均匀度等形态学指标来选择胚胎进行移植。有报道认为D3卵裂球数量代表胚胎的卵裂率，被认为是预测胚胎发育潜力和妊娠结局的最关键指标[2]，且许多研究表明细胞数量与胚胎发育潜力相关[2-3]。然而，临床上对于ICSI来源的胚胎其卵裂球数量与新生儿结局的相关性研究报道较少。随着ICSI应用范围不断扩大以及单胚胎移植策略的广泛应用，有必要确定一套非侵入性、性价比高且实用的标准来指导ICSI周期单胚胎选择。因此，本研究拟通过回顾性分析新鲜ICSI移植周期患者的临床资料，探讨新鲜ICSI移植周期D3胚胎卵裂球细胞数对ART妊娠结局及新生儿子代的影响，为进一步改善新鲜ICSI移植周期胚胎选择策略、提高单胚胎移植成功率以及优生优育提供理论依据。

资料与方法

一、研究对象及分组

回顾性分析2018年1月至2020年12月在我院生殖医学中心行ICSI治疗的2 618个周期的临床资料。

纳入标准：(1)新鲜D3卵裂期单胚胎移植；(2)夫妻双方染色体核型正常；(3)女方宫腔形态正常，无不良孕产史及反复流产病史。

排除标准：(1)染色体异常患者；(2)子宫畸形及其他内分泌代谢性疾病；(3)数据缺失周期。

根据D3移植胚胎的卵裂球数目共分为6组：≤6细胞组(78例)、7细胞组(199例)、8细胞组(1 936例)、9细胞组(178例)、10细胞组(163例)和≥11细胞组(64例)。该研究的实施通过本院医学伦理委员会批准，患者夫妻双方了解并知情同意。

二、研究方法

1.促排卵方案及取卵：患者均采用本中心常规的GnRH-a长方案、拮抗剂方案或超长方案促排卵，根据卵巢反应性调整促排药物剂量，依据卵巢激素水平和阴道B超监测卵泡发育。若B超监测发现有3个以上主导卵泡直径达到≥18 mm时，当晚给予肌肉注射重组人绒毛膜促性腺激素(艾泽，默克雪兰诺，瑞士)250 μg或人绒毛膜促性腺激素(HCG，珠海丽珠)8 000～10 000 U诱发排卵，HCG注射36～37 h后经阴道超声引导下穿刺取卵。

2.胚胎培养、评估及移植：ICSI授精后16～18 h观察卵母细胞受精情况，受精后第2天(D2)、第3天(D3)观察胚胎卵裂情况，记录胚胎卵裂球细胞数、碎片化程度、细胞大小均一度。移植胚胎的选择主要根据D3胚胎形态，兼顾考虑原核期和D2胚胎形态。挑选1枚D3卵裂期胚胎进行移植，其余胚胎进行冷冻或继续培养至囊胚期冷冻。原则上优先选择D3优质卵裂期胚胎进行移植，若无优质卵裂期胚胎则在患者知情同意后选择非优质胚胎进行移植。

3.观察指标：临床妊娠定义为胚胎移植后4周经阴道超声检查见孕囊者，临床妊娠率=该组临床妊娠周期数/该组总周期数×100%。若患者出现临床妊娠，但在后续发育过程中出现胚胎停育或因发现胎儿畸形而人为终止妊娠者，该周期妊娠结局定义为流产，流产率=该组流产周期数/该组妊娠周期数×100%。胎儿娩出并具有生命体征的周期，结局定义为活产，活产率=该组活产周期数/该组总周期数×100%。在活产周期中，妊娠满20周但在37周前分娩的新生儿为早产儿；出生体重<2 500 g的新生儿为低出生体重儿；出生体重>4 000 g的新生儿为巨大儿。

三、统计学分析

采用SPSS 28.0统计学软件进行数据分析，使用 Kolmogorov-Smirnov 检验评估数据分布，发现各研究指标均不满足正态分布和方差齐性，计量资料以中位数(最小值～最大值)[M(min，max)]表示，组间比较采用Kruskal-Wallis检验。计数资料以率(%)表示，组间比较采用R×C列联表χ2检验和Fisher确切概率法。P<0.05被认为差异有统计学意义。在将每组与8细胞组进行比较时，依据用于多重比较的Bonferroni校正，校正后P<0.01被认为差异具有统计学意义。

结 果

一、患者一般资料比较

各组间患者移植时年龄、基础促卵泡生成素(bFSH)、身体质量指数(BMI)、原发不孕比例、不孕年限及子宫内膜厚度等指标均无显著差异(P>0.05)(表1)。

表1 各组患者的基线资料比较[M(min，max)，n(%)]

二、各组患者的妊娠结局比较

在新鲜ICSI移植周期中，8细胞组临床妊娠率、活产率显著高于≤6细胞组、7细胞组和9细胞组(P<0.01)；10细胞组和≥11细胞组临床妊娠率和活产率略低于8细胞组，差异尚无统计学意义(P>0.01)(表2)。≤6细胞组中5细胞移植周期活产1例，6细胞移植周期活产8例。

表2 各组间妊娠结局比较(%)

三、新生儿结局比较

各组间活产婴儿的孕周、男婴占比、出生体重、早产儿、巨大儿等指标差异均无统计学意义(P>0.01)，但7细胞组低出生体重儿占比显著高于8细胞组(P<0.01)(表3)。各组均无出生缺陷儿出生，有7个妊娠周期在产检过程中发现胎儿发育异常，包括1例骨畸形(移植8细胞)，3例心脏发育畸形(2例8细胞、1例10细胞)，1例宫内发育迟缓(8细胞)，2例胎儿染色体异常(1例8细胞、1例7细胞)，均及时行引产手术。

表3 各组间新生儿结局的比较[M(min，max)，n(%)]

讨 论

1992年卵胞浆内单精子显微注射技术(ICSI)的问世解决了男性不育的难题，ICSI凭借其高受精率和可以降低完全受精失败风险的优点，应用范围不断扩大。与此同时，人们却不得不关注其所带来的医源性子代安全性问题。随着临床个体化控制性卵巢刺激方案的改进和胚胎培养体系的精准提高，新鲜周期胚胎移植策略不仅可以获得较高的临床妊娠率，还可以避免胚胎冷冻复苏损伤的风险，因此受到越来越多患者的亲睐[4-5]。鉴于ICSI广泛应用以及D3新鲜卵裂期胚胎移植是当今许多辅助生殖中心的常规做法，本研究将重点关注ICSI来源胚胎卵裂球数量对新鲜单胚胎移植周期妊娠结局及新生儿结局的影响，以期为临床提供更好的单胚胎选择策略，提高临床妊娠率，实现优生优育。

目前，胚胎形态学评估依然是各大生殖中心最主要和最常用的评估方法。如何提高这种方法的有效性也是临床和实验室工作的重点。评价胚胎质量的形态学标准通常由卵裂球数目、细胞均一性和碎片化程度决定。卵裂球数目被认为是预测囊胚形成、胚胎植入率和活产率最关键的指标之一。目前，普遍认为第3天(D3)8细胞胚胎具有最好的发育潜能，而细胞数较少的胚胎预后较差[2-3，6]。Li等[7]研究发现，4～5和6细胞组的胚胎着床率和临床妊娠率明显低于7～9和>9细胞组，而流产率则明显增高；6细胞组D3胚胎着床率和临床妊娠率明显下降，不属于优质胚胎。本研究也发现≤6细胞组D3胚胎临床妊娠率低，流产率增加，可能与卵裂球数目低的D3胚胎发生非整倍体风险高有关。目前一致认为慢分裂胚胎发育潜能低，而对于快分裂胚胎的发育能力仍存有争议。有研究报道，活产率与细胞数增加至8细胞呈正相关，而细胞数超过8细胞则活产率降低[8]。有研究在研究胚胎发育和倍性的相关性时发现，快速分裂的胚胎染色体畸变率更高[9]。Kroener等[10]建议优先移植6～9细胞的胚胎，而不是>9细胞胚胎。然而，Pons等[11]研究结果提示9～11细胞胚胎的整倍体率低于8细胞胚胎，而11细胞以上的胚胎获得整倍体囊胚的概率与8细胞相同，当分裂胚胎的整倍体囊胚被移植时，可表现出与8细胞胚胎的整倍体囊胚相似的植入率和活产率。本研究结果也提示优先推荐8细胞胚胎进行移植，其次为≥11细胞胚胎和10细胞胚胎；9细胞胚胎和7细胞胚胎具有相似的临床结局，但7细胞组胚胎低出生体重儿风险增加；≤6细胞胚胎临床结局最差，但依然有健康活产的机会。

利用延时成像技术对胚胎发育进行非侵入性观察是近期提出的一种更好的胚胎活力评估方法，它可以记录和注释胚胎发育的信息，通过特定参数对胚胎发育潜能和妊娠结局进行预测。有研究认为从一个到三个卵裂球的直接卵裂、四细胞阶段的多核化以及两细胞阶段的卵裂球大小均会影响胚胎活力和植入潜能[2]。胚胎活力还与受精时开始的一系列严格调控的细胞事件相关[12]。尽管该技术在当代 ART 应用中占据了重要地位，但技术改进以及开发用于选择最可行胚胎的有效算法目前还不够理想。延时成像技术的临床有效性和安全性一直存有争议[13]。当前延时成像系统的主要缺点之一是胚胎培养组件不允许胚胎旋转，尤其是当卵裂球重叠或存在大量的细胞质碎片时，目视观察变得有所“失真”[14]，甚至这种胚胎“美颜”的效果图并不能真实反映胚胎的植入潜能，从而为胚胎选择带来一定误导。其次，胚胎每5～15 min暴露于内置摄像系统的光照下，如果计算整个培养过程中每个胚胎拍摄图像总数，光照周期会大大增加，其安全性问题则值得担忧[15]。此外，成本/效益比也是一个非常重要的因素，延时培养系统不仅价格昂贵，而且还需要专业人士定期进行维护，这对于生殖周期有限的中心来说实用价值有限。因此，在现有形态学评估标准基础上，确定一套实用、廉价、非侵入性的标准来提高胚胎选择效率就具有十分重要的意义。本研究也存在一定的局限性。本研究是一项针对新鲜胚胎移植周期的单中心回顾性研究，无法排除新鲜周期高雌激素环境对胚胎植入的可能影响。有关D3胚胎卵裂球数目与胚胎倍性的相关性，有待后续研究中进一步验证，以完善此评估方法，证实其临床有效性。

综上所述，当同时存在多个可供移植的胚胎时，推荐优先移植8细胞胚胎。此外，10个以上细胞的胚胎也表现出较好的临床结局。本研究结果表明，D3胚胎的卵裂球数量可作为移植前胚胎评估与筛选的标准之一，有助于在临床实践中提高新鲜周期单胚胎移植的成功率。