李世荣，田月如，王钰婷，林怡箐，关 明，蒋浩琴

复旦大学附属华山医院检验科，上海 200040

传统对病原菌鉴定的方法需要观察细菌在各种培养基中的菌落形态、颜色、气味、是否溶血等，还需借助革兰染色、氧化酶和触酶等一系列生化反应，不仅操作烦琐，所需时间较长，而且灵敏度和特异度较低，致使临床治疗方案难以及时制订而极大地影响了患者的生存率和病死率[1]。近些年发展的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)是一项包括微生物在内众多物质的快速鉴定新技术，除了能对不同细菌的种、属准确的鉴定外，还具有快速、方便和成本较低的优势[2]，甚至一度被认为是可替代基因测序的方法[3]。MALDI-TOF MS的原理是将标本和基质混合涂抹于金属靶板上，形成的共结晶薄膜，经激光照射后，标本分子获得能量解吸附，基质和标本之间发生了电荷的转移,标本分子获得了质子并成为离子，后者在电场中飞速运动、聚焦，并进入飞行时间探测器。由于离子质荷比与飞行时长的平方比为常数，不同质荷比的离子具有不同的飞行时长，因此可依据获得的质谱图与图谱库进行对比，从而对不同的物质进行鉴别[4]。CMI-3800 MS是国内研发的一款质谱鉴定系统，对细菌鉴定性能目前还缺乏相应的数据评估。本文旨在通过利用该检测系统对临床常见302株非重复病原菌进行鉴定，客观评估其对临床病原菌鉴定结果的准确性。

1 资料与方法

1.1菌株来源 收集本院2021年3-5月来自临床不同标本(血液、脑脊液、腹腔积液、 尿液、脓液、伤口分泌物和痰等) 分离的常见非重复菌株共302株，其中革兰阳性菌88株，包括葡萄球菌35株，肠球菌21株，链球菌24株，其他8株；革兰阴性菌157株，包括肠杆菌86株，非发酵菌45株，其他26株；念珠菌57株。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922，购自上海市临床检验中心。

1.2仪器与试剂 CMI-3800 MS及配套试剂、菌种数据库均购自广州禾信康源医疗科技有限公司； VITEK 2 Compact鉴定仪；GP革兰阳性菌鉴定卡、GN革兰阴性菌鉴定卡、YST念珠菌鉴定卡、NH苛氧菌鉴定卡、ANC厌氧菌棒状杆菌鉴定卡购自法国生物梅里埃公司；沙保弱培养基和血培养琼脂平板均购自上海科玛嘉微生物技术有限公司； 35 ℃ CO2孵箱购自美国赛默飞世尔科技公司；厌氧发生袋购自OXOID公司。

1.3方法

1.3.1病原菌培养 将收集的菌株从-70 ℃低温冰箱中取出，用1 μL一次性接种环以四区划线的方式接种于血琼脂平板。革兰阳性或阴性需氧菌和兼性厌氧菌、念珠菌采用35 ℃ CO2孵箱培养18～24 h，难以生长的细菌可延迟至2～3 d；厌氧菌放入厌氧发生袋中密封后放入35 ℃ CO2孵箱培养中培养2～3 d，得到菌落后，为保证菌落必须为纯菌落，再纯分一次，以相同条件培养。

1.3.2VITEK 2 Compac鉴定仪鉴定 根据纯菌落形态、革兰染色结果以及简单的生化实验结果选择相对应的细菌鉴定卡上机鉴定。革兰阳性需氧菌采用GP细菌鉴定卡、革兰阴性需氧菌采用GN细菌鉴定卡、念珠菌采用YST细菌鉴定卡、奈瑟菌等苛氧菌采用NH细菌鉴定卡、厌氧菌和棒状杆菌采用ANC细菌鉴定卡。使用前将卡片和0.45%氯化钠(NaCl)溶液从4 ℃冰箱取出，放室温15～20 min，充分复温。每根试管中加入3 mL 0.45% NaCl溶液配制菌悬液，并用比浊仪测定菌液浓度。将革兰阳性或阴性需氧菌配制成0.50～0.63 McF的菌悬液浓度，念珠菌配制成1.8～2.2 McF的菌悬液浓度，奈瑟菌等苛氧菌、厌氧菌、棒状杆菌配制成2.7～3.3 McF的菌悬液浓度。将配制好的菌悬液依次放在载卡架上，按照操作说明完成上机鉴定。

1.3.3CMI-3800 MS鉴定 35 ℃ CO2孵箱培养18～24 h得到纯菌落后，用1 μL一次性接种环将校准菌株大肠埃希菌ATCC25922均匀涂在靶板的校准点位上，将待测纯菌落均匀涂在测试点位上，涂菌后添加1 μL甲酸溶液(FA)，干燥后加1 μL α-腈基-4-羟基肉桂酸(CHCA)基质液，再次干燥后将样品靶放入靶板槽中盖好换样盖板，进靶，设置标准标本和盲样，开始鉴定。病原菌的纳入标准： CMI-3800 MS鉴定到种的得分>8.00分，鉴定属的得分>6.00分；VITEK 2 Compact鉴定置信度≥89.00%。

1.3.4鉴定结果不一致标本处理 对于两种方法鉴定不一致的菌株，重新接种平板复测确认，确认不一致的菌株送上海迈浦生物科技有限公司进行16SrDNA测序。扩增长度为1 500 bp，扩增区域为16S的全长序列。细菌16S PCR的引物为：27F：AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG；1492R：GGT TAC CTT GTT ACG ACT T。测序完成后，在NCBI数据库里比对，得到菌株的最终鉴定结果。

1.4统计学处理 采用Excel进行数据处理，计数资料采用例数或百分率表示。

2 结 果

2.1CMI-3800 MS和VITEK 2 Compact对286株菌的鉴定 对302例菌株标本进行分析，CMI-3800 MS鉴定到属水平有297株，占98.34%，鉴定到种水平有288株，占95.36%；VITEK 2 Compact鉴定到属水平有296株，占98.01%，鉴定到种水平有277株，占91.72%。两种仪器检测到属水平一致的为296株，占98.01%，种水平一致的为277株，占91.72%； 6株鉴定结果属不一致，占1.99%，25株鉴定结果种不一致，占8.28%。

2.2CMI-3800 MS和VITEK 2 Compact对革兰阳性和阴性菌的鉴定 表1与表2分别为革兰阳性菌与革兰阴性菌的详情。如表1所示，在88株革兰阳性菌中，CMI-3800 MS鉴定到属的为88株(100.00%)，鉴定到种的为84株(95.45%)。

表1 革兰阳性菌株(n=88)

表2 革兰阴性菌株(n=157)

VITEK 2 Compact鉴定到属的为86株(97.73%)，鉴定到种的为79株(89.77%)。两种方法在属水平一致性为97.73%，在种水平一致性为89.77%。

在157株革兰阴性菌中，CMI-3800 MS鉴定到属的为154株(98.09%)，鉴定到种的为148株(94.27%)；VITEK 2 Compact鉴定到属的为153株(97.45%)，鉴定到种的为142株(90.45%)。两种方法在属水平上一致性为96.82%，在种水平上一致性为90.45%。见表3。

表3 CMI-3800 MS和VITEK 2 Compact对革兰阳性和阴性菌株的鉴定(%)

2.3念珠菌鉴定结果 57株念珠菌，CMI-3800 MS可将57 株(100.00%)鉴定到属，57株(100.00%)鉴定到种；VITEK 2 Compact可将57株(100.00%)鉴定到属，56株(98.25%)鉴定到种，两种方法在种的一致性为98.25%，在属的一致性为100.00%。见表4。

表4 念珠菌菌株明细(n=57)

2.416SrDNA 基因测序 25株种不一致的标本中(其中包括属不一致6株)，有7株细菌蛋白质指纹图谱相似，属于质谱方法学难以区分菌株，故对其余18株属或种不一致的菌株进行16SrDNA 基因测序鉴定。18株标本的16SrDNA 基因测序鉴定结果中有12例标本与CMI-3800 MS鉴定的种水平完全一致，4株样本属水平一致，其余2例种属均不一致； 16SrDNA 基因测序鉴定结果与VITEK 2 Compact鉴定结果相比较，13株属一致，4株种属均不一致，有1例VITEK 2 Compact鉴定仪未鉴定出来，见表5、6。

表5 7株质谱方法学难以区分菌株

表6 18株菌3种方法鉴定结果比较

3 讨 论

MALDI-TOF MS技术已被证实在耐药性分析和感染控制方面具有广阔的应用前景[5]，不仅可实现快速的耐药分析，而且可精确地对传染疾病的病原菌进行诊断[6]。最近周淑燕等[7]用法国生物梅里埃MALDI-TOF-MS和VITEK 2 Compact对300 株临床分离的病原菌进行了鉴定，法国生物梅里埃MALDI-TOF-MS鉴定到种水平的菌株有268 株(89.33%)，属水平的菌株有297 株(99.00%)；VITEK 2 Compact鉴定到种水平有266 株(88.67%)； 属水平的菌株有297 株(99.00%)。本研究用CMI-3800 MS与VITEK 2 Compact对302株菌株进行了分析，CMI-3800 MS鉴定到属水平有297株(98.34%)，鉴定到种水平有288株(95.36%)；VITEK 2 Compact鉴定到属水平有296株(98.01%)，鉴定到种水平有277株(91.72%)。比较MALDI-TOF MS系统检测能力，CMI-3800 MS检测属水平(98.34%)与法国生物梅里埃MALDI-TOF MS(99.00%)相仿，但前者检测种水平(95.36%)明显高于后者(88.67%)。另外，周淑燕等[7]用两种方法鉴定的种属一致性分别为82.67%与98.33%。由此可见，CMI-3800 MS对细菌检测能力和梅里埃MALDI-TOF-MS相当。另外，本研究两种方法检测种不一致的25株(其中包括属不一致6株)中，由于有7株细菌的蛋白质指纹图谱十分相似而难以用质谱方法学区分，为此本文用16SrDNA 基因测序对18株属或种不一致的菌株进行了鉴定。结果表明，16SrDNA 基因测序确认与CMI-3800 MS鉴定种、属水平一致的分别为12株(66.67%)和16株(88.89%)； 16SrDNA 基因测序与VITEK 2 Compact鉴定细菌为属一致的有13株(72.22%)，4株种、属均不一致，有1例菌株为惰性乳杆菌，其生长速度缓慢，故VITEK 2 Compact未能鉴定出结果。显然，对少见菌鉴定的成功率和准确程度，CMI-3800 MS无疑比VITEK 2 Compact更胜一筹，更符合临床对菌株样本检测的需求。

革兰阳性菌和革兰阴性菌为临床常见的细菌。王冰等[8]用Biotyper MS和 Vitek-MS对63株革兰阳性菌和83株革兰阴性菌进行了鉴定，结果显示两种MS系统对革兰阳性菌和革兰阴性菌的种属鉴定率均达95.00%，表明MALDI-TOF MS质谱检测系统可对它们的种属进行有效的鉴定。在本研究收集的302株菌株中，81.13%(245/302)的菌株为革兰阳性菌和革兰阴性菌。CMI-3800 MS对革兰阳性菌种属的鉴定率分别为95.45%(84/88)和100.00%(88/88)，对革兰阴性菌种属的鉴定率分别为94.27%(148/157)和98.09%(154/157)；VITEK 2 Compact对革兰阳性菌种属的鉴定率分别为89.77%(79/88)和97.73%(86/88)，对革兰阴性菌种属的鉴定率分别为90.45%(142/157)和97.45%(153/157)。显然CMI-3800 MS对革兰阳性菌和革兰阴性菌鉴定种的能力均高于VITEK 2 Compact。 然而，CMI-3800 MS对革兰阴性菌中包括大肠埃希菌与志贺菌属、沙门菌群、阴沟杆菌复合群、不动杆菌复合群等未能很好鉴定，除了可能与这些革兰阴性细菌蛋白质指纹图谱相似而难以区分外，亦与MALDI-TOF MS数据库中缺乏某些菌属如志贺菌属[9]的数据有关，因此,在对沙门志贺菌进行鉴定时，一定要辅以血清学试验结果作为最终的鉴定结果[10]。此外，在本研究中有1株人金黄杆菌和1株金色金色微菌也未能被CMI-3800 MS检测系统鉴定，其原因可能是数据库里菌株数量过少而无法达到质谱检测灵敏度的要求，或是细菌数据库里未储存该菌种。

分析CMI-3800 MS对革兰阳性菌中不同菌属的鉴定能力，对肠球菌属和葡萄球菌属的种属鉴定率均为100.00%，对链球菌的种属鉴定率则分别为83.33%(20/24)和100.00%(24/24)，表明CMI-3800 MS对链球菌种的鉴定能力相对较弱，这与木尼热·马合苏提等[11]用VITEK-MS对链球菌种的鉴定率(84.80%)十分接近，该文作者认为MS对链球菌种的鉴定率之所以比较低的原因可能是与链球菌之间的亲缘关系比较相近或蛋白指纹图谱峰的特征不明显有关，陆丹等[12]建议，在链球菌的鉴定中，应根据实际情况结合其他辅助方法做出正确判断，如进行奥普托欣敏感试验。

王琦琦等[13]研究表明，MALDI-TOF MS可准确鉴定98.30%的念珠菌，对常见念珠菌鉴定的准确率为100.00%，而对少见念珠菌的鉴定准确率为95.70%。本研究CMI-3800 MS对57株念珠菌种属鉴定率均为100.00%；而VITEK 2 Compact对它们属的鉴定率为100.00%(57株)，种的鉴定率为98.25%(56株)。尽管耳念珠菌与希木龙念珠菌有较近的亲缘关系[13]，但研究表明MALDI-TOF MS仍能够准确地区分这两种念珠菌[14-16]，并且MURO等[17]研究还认为，MALDI-TOF MS对希木龙念珠菌的鉴定比VITEK 2 Compact鉴定仪更为精准。在本研究中VITEK 2 Compact鉴定仪就是将1株希木龙念珠菌鉴定为耳念珠菌，而CMI-3800 MS则准确地把这1株念珠菌区分了出来。

综上所述，CMI-3800 MS具有对临床菌株检测准确率高、通量大、重复性好、操作简单和菌种数据库完善等优势，鉴定每株细菌的耗材成本较低，每日可鉴定微生物高达3 500株，可以满足临床实验室对微生物鉴定的需求。