姜玉松 李洪雷 李哲馨 徐晓玉 李隆云 黄孟军,

（1西南大学资源环境学院，400715，重庆；2重庆文理学院特色植物研究院，402160，重庆；3重庆市中药研究院中药生药研究所，400065，重庆）

植物转录因子种类繁多，包括MYB[1-2]、CBF[3-4]、NAC[5-6]和 WRKY[7]等，其中 WRKY 家族是植物特有的转录调控因子，含有一段约60个氨基酸残基的WRKY保守结构域，包括N端的WRKYGQK七肽序列和C端的锌指结构（zincfinger motif）[8]。根据WRKY结构域数目的差异，WRKY蛋白可分为Ⅰ和Ⅱ亚族，其中亚族Ⅰ含有2个WKRY结构域，其他亚族含有1个WKRY结构域[9]；结合C端锌指结构域的差异，又可分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ亚族，其中Ⅱ亚族又细分为Ⅱ-a+Ⅱ-b、Ⅱ-c和Ⅱ-d+Ⅱ-e 亚组[10]。

WRKY转录因子广泛参与植物系统发育[11-12]、逆境应答[13-14]和转录激活[15-16]等过程。LbWRKY3基因参与枸杞（Lycium barbarum L.）果实生长发育调控[17]；CaWRKY40和CaWRKY6在辣椒（Capsicum annuum）应答青枯菌和高温胁迫的过程中具有正向调控作用[18]；MeWRKY20、MeWRKY21和MeWRKY24等16个WRKY基因调控木薯（Manihot esculenta）抗细菌性病害响应[19]。近年来，随着大规模高通量测序的开展，越来越多的物种完成了WRKY家族信息的鉴定，如拟南芥包含72个WRKY成员[20]，粳稻和籼稻分别有98和102个[21]，番茄有81个[22]，棉花有116个[23]等。

生姜是姜科植物姜（Zingiber officinale Roscoe）的根状茎，具有药食两用的特点，因具有单位面积产量高和经济效益好等巨大优势，是一种值得推广的经济作物[24]。然而，生姜在旺盛生长期（6-9月）易遭受环境水分和青枯菌侵染等胁迫，对其生长、品质和产量有重要的影响。借助生物信息学手段可深入分析生姜对逆境胁迫的响应，挖掘抗性基因，解析转录因子介导的抗性调控机制。由于生姜基因组杂合性较高的限制，基因组测序工作一直没有完成，导致分子生物学研究相对迟缓，特别是关于生姜ZoWRKY转录因子的研究更为少见。本研究在生姜转录组数据分析的基础上，鉴定了ZoWRKY家族成员，并分析了不同土壤湿度和青枯菌侵染下ZoWRKY基因的逆境响应模式，对后续开展ZoWRKY转录因子功能研究、推进生姜抗性育种和提高生姜产量具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验以生姜品种西南竹根姜（Zingiber officinale Roscoe cv.Zhugen）为材料。生姜组培苗栽培于重庆文理学院特色植物研究院温室。温度30℃，土壤湿度（充水孔隙度，water-filled pore spaces，WFPS）为10%、25%、30%和 40%，光强200μE/(m2·s)，光周期为14h光照/10h黑暗），生长至3股杈（约90d）时进行青枯菌（Ralstonia solanacearum）侵染处理。侵染接种前，对各湿度条件下的生姜根茎进行创伤，然后用浓度为106cfu/mL的青枯菌悬浮液对处理组生姜的土壤进行浸渍接种，同时，以无菌水接种为对照。生长至6个月，收集不同土壤湿度和青枯菌侵染处理的生姜地下肉质根、地下根茎、地上茎和叶片等组织，置于液氮中快速冷冻，-80℃中保存用于提取RNA。

1.2 RNA-Seq测序

按照Trizol试剂盒说明书分别提取生姜各组织总RNA，经检测合格后等量混合，基于Illumina公司Hiseq 4000（Illumina，美国）平台进行转录组测序，采用Trinity软件拼接获取Unigenes。

1.3 ZoWRKY转录因子基因筛选

利用Galaxy网站（https://usegalaxy.org/）的EMBOSS程序预测生姜Unigenes的开放阅读框（ORF），获取生姜Unigenes编码蛋白质数据库。从EMBL-EBI网站（https://pfam.xfam.org/）下载WRKY保守域种子序列（序列号PF03106），利用HMMER 3.0软件建立数值表格型隐马可夫模型（Profile HMM），检索生姜Unigenes编码蛋白质数据库。根据WRKY保守结构域序列覆盖度和E值等参数，利用Perl脚本语言筛选获得覆盖度高、置信度高的ZoWRKY转录因子序列。

1.4 ZoWRKY转录因子的系统进化分析

从PlantTFDB数据库（http://planttfdb_v3.cbi.pku.edu.cn/）下载拟南芥AtWRKY家族蛋白序列作为参考序列，运用MEGA-X的Multiple alignments程序对AtWRKY参考序列和筛选到的ZoWRKY蛋白序列进行多重比对，将比对结果采用邻接法（neighbor-joining method）构建系统进化树，参数设置为Poisson model、Pairwise deletion和Bootstrap（重复1000次）。

1.5 ZoWRKY序列保守结构域分析

利用DNAMAN 7.0软件分别对筛选到的ZoWRKY蛋白序列进行多序列比对，获得保守结构域区域。利用MEME（http://meme-suite.org/）和WebLogo 3（http://weblogo.threeplusone.com/）对ZoWRKY保守结构域序列标签进行分析。

1.6 ZoWRKY理化性质分析

采用ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）分析ZoWRKY编码氨基酸序列长度、分子量大小和理论等电点等信息。采用SOPMA（htttp://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/nps.）获取二级结构相关信息。

1.7 ZoWRKY基因的逆境响应模式分析

从NCBI网站下载不同WFPS（10%、25%、30%和40%）和青枯菌（R.solanacearum）侵染前后的生姜根茎转录组数据（Bioproject：PRJNA380 972），利用Bowtie 2.0软件（http://bowtie-bio.source forge.net/bowtie2/index.shtml）将下载的转录组reads数据与筛选到的ZoWRKY基因进行映射分析。使用Trinity包的Perl脚本语言，计算并归一化获得每个ZoWRKY基因的FPKM（Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads）值，分析ZoWRKY基因家族对不同土壤湿度及青枯菌侵染的逆境响应表达水平。

2 结果与分析

2.1 RNA-Seq测序及组装

用Illumina HiSeq™进行混合RNA样品二代转录组测序，共产生27 645 008对Paired-End reads（表1）。经过Trinity组装、cd-hit-est聚类后获得381 871条无冗余、长度大于300bp的Unigenes，平均长度为891bp，N50长度为1260bp，最大长度为16 953bp，GC比例为45.30%的340.2Mb生姜转录组数据。

表1 生姜转录组组装统计Table 1 Statistics of transcriptome assembly in ginger

2.2 ZoWRKY筛选及全长序列的获取

381 871条Unigenes经EMBOSS程序预测获得106 653条蛋白序列（长度≥150），利用HMMER 3.0软件质询WRKY保守域种子序列（序列号PF03106），设置序列覆盖度＞90%和Independent E value＜0.01，共筛选获得78条序列不同的ZoWRKY蛋白。参照生姜近缘物种香蕉MaWRKY家族基因序列，其中72条ZoWRKY具有完整的ORF序列，而Zoff188265等6条仅有部分ORF序列。

对 Zoff188265、Zoff210606、Zoff217771、Zoff244943、Zoff295642和Zoff614319等6条无完整ORF序列的ZoWRKY转录因子进行Race-PCR扩增。首先基于无完整ORF序列的ZoWRKY序列设计5′和3′端特异性引物，准备好反应所需酶系和体系，然后借助Race-PCR试剂盒（Clontech，Mountain View，美国）分别进行cDNA第1条链和第2条链的合成。Race-PCR试验成功获得其全长ORF序列，其中Zoff614319的ORF长度最短，为600bp，Zoff295642的ORF长度最长，为2499bp。

2.3 ZoWRKY系统进化分析

以拟南芥AtWRKY蛋白序列为指导，利用MEGA-X对AtWRKY和ZoWRKY蛋白序列进行多序列比对，用Neighbor Joining法构建系统进化树。根据7个不同亚族的AtWRKY序列与78条ZoWRKY序列的聚类情况，将ZoWRKY转录因子分成3个亚族，亚族Ⅰ有14个成员；亚族Ⅱ有55个成员，其中Ⅱ-a、Ⅱ-b、Ⅱ-c、Ⅱ-d和Ⅱ-e分别有10、12、11、14和8个成员；亚族Ⅲ有9个成员（图1）。

图1 生姜与拟南芥WRKY转录因子家族成员系统进化关系Fig.1 Phylogenetic relationships of WRKY transcription factors in Zingiber and Arabidopsis

2.4 ZoWRKY保守结构域分析

利用MEME和WebLogo3对ZoWRKY序列的保守结构域进行分析，78条ZoWRKY序列均含有高度保守的WRKY结构域（图2a）。采用在线软件SWISS-MODEL进行三维结构同源建模，结果（图2b）显示，ZoWRKY保守结构域的三维模型与模式植物拟南芥的WRKY结构域高度相似，由β1～β4共4个β-折叠结构域和1个锌离子（Zn2+）结合位点组成。

图2 ZoWRKY蛋白保守结构域序列标签(a)及三维结构模型(b)Fig.2 The sequence tags(a)and three-dimensional structural model(b)of the WRKY conserved domain in ZoWRKY proteins

ZoWRKY亚族保守结构域分析结果（图3）显示，亚族成员的WRKY结构域保守度较高，个别成员发生WRKYGQK七肽域变异和锌指结构变异。亚族Ⅰ含有2个WRKY保守结构域，根据其在序列中的位置又进一步分为Ⅰ-N和Ⅰ-C亚族。亚族Ⅰ-N的WRKY七肽域为WRKYGQK，锌指结构为CX4CX22-23HXH形式。亚族Ⅰ-C的WRKY七肽域中为WRKYGQK，锌指结构为CX4CX23HXH形式。与亚族Ⅰ不同，亚族Ⅱ和Ⅲ只有1个WRKY保守结构域，根据亚族Ⅱ的氨基酸序列差异，进一步分为Ⅱ-a、Ⅱ-b、Ⅱ-c、Ⅱ-d和Ⅱ-e。其中，亚族Ⅱ-a、Ⅱ-b、Ⅱ-d和Ⅱ-e的WRKY七肽域和锌指结构为WRKYGQK和CX5CX23HXH形式，亚族Ⅱ-c的为WRKYGQK和CX4CX23HXH形式。亚族Ⅲ的WRKY七肽域和锌指结构为WRKYGQK和CX7CX23HXC形式。

图3 ZoWRKY转录因子保守结构域分析Fig.3 Sequence analysis of the WRKY conserved domain in ZoWRKY proteins

2.5 ZoWRKY氨基酸组成及结构预测分析

对ZoWRKY进行ProtParam分析（表2）表明，不同亚族之间的氨基酸残基数目、相对分子质量和等电点等理化性质存在差异。亚族Ⅰ的氨基酸残基数目最多，平均为490个，相对分子质量最高（53.6kDa）；亚族Ⅱ-a的氨基酸残基数目最少，平均为210个，相对分子质量最低（23.5kDa）。ZoWRKY的等电点大多数在碱性范围。

表2 ZoWRKY转录因子氨基酸理化分析Table 2 Physicochemical analysis of amino acid in ZoWRKY transcription factors

续表2 Table 2(continued)

通过Sopma网站预测蛋白质二级结构，ZoWRKY成员中α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲等结构在全序列中的占比差异较大，但构成元件中主要为无规则卷曲，平均占比大于70%。亚族Ⅰ的α-螺旋占比最低，平均为2.63%；亚族Ⅲ的α-螺旋占比最高，平均为17.85%。

2.6 ZoWRKY家族对逆境的响应模式

基于不同WFPS（10%、25%、30%和40%）及青枯菌侵染处理的生姜根茎转录组数据，分析ZoWRKY基因对逆境胁迫的响应。Zoff129734等7个ZoWRKY基因在高湿度土壤中上调表达，主要分布在亚族Ⅱ-c和Ⅱ-d，其中Zoff204548、Zoff129734、Zoff290286、Zoff407487和 Zoff178498分别上调了2.89、12.52、4.20、3.66和5.26倍。而Zoff193573等14个ZoWRKY基因下调表达，主要分布在亚族Ⅱ-a、Ⅱ-b和Ⅲ中，其中Zoff193573、Zoff224514、Zoff224527、Zoff109660和 Zoff554263分别下调至 0.02、0.06、0.06、0.03和0.04（图 4a）。

青枯菌侵染分析发现，Zoff186957等19个ZoWRKY基因显著响应青枯菌侵染，其中在侵染过程中显著上调表达的5个主要分布亚族Ⅱ-b和Ⅱ-c中，Zoff147627、Zoff165467、Zoff186957、Zoff244550和Zoff536230分别上调了7.03、3.44、37.62、2.87和 7.38倍。而 Zoff129734等 14个ZoWRKY基因下调表达，主要分布在亚族Ⅰ、Ⅱ-a和Ⅲ中，其中 Zoff129734、Zoff146524、Zoff224526、Zoff258147和Zoff301103分别下调至0.02、0.07、0.17、0.03和0.09（图4b）。

图4 ZoWRKY基因对逆境的响应分析Fig.4 Expression analysis of ZoWRKY gene under stress conditions

3 讨论

WRKY转录因子广泛存在于植物体内，是植物重要的转录调控因子家族，通过功能域识别和结合靶基因启动子上的顺式作用元件W-box（TTGACC）或SURE（糖响应顺式作用元件）[25]，调控靶基因在转录水平上的重编程，在植物生长发育、代谢等生理过程及应答环境胁迫和防御病原菌侵染等过程都有着重要作用[16]。

基于生姜转录组数据共筛选鉴定出78个ZoWRKY家族成员，多于拟南芥的72个WRKY基因，少于番茄的81个和苹果的132个[20,22,26]。由于生姜的基因组测序还未完成，目前的数据通过无参考基因组转录组测序获得，而转录组测序的深度、拼接效果及基因转录时空差异等诸多原因，可能会导致WRKY家族成员鉴定的缺失，其准确性还有待基因组数据获得后开展进一步的验证。然而，在现有研究条件下，借助转录组数据挖掘生姜及其他无基因组信息植物的关键基因仍是一条重要的途径。

ZoWRKY聚类为3个亚族，共7个组别，与拟南芥[27]、烟草[28]和苹果[26]中的分类情况一致，表明WRKY家族成员在物种中保守性较高。ZoWRKY成员含有WRKY序列（WRKYGQK）和锌指结构（C2H2或C2HC型）为核心的WRKY保守结构域，部分成员的保守结构域中存在WRKYGQK七肽域变异和锌指结构变异，也展示了WRKY家族的多样性。序列预测分析显示，ZoWRKY与基因组完善的物种（如拟南芥和番茄等）WRKY分组数量、理论等电点及相对分子质量等理化性质相接近，特别是与生姜近缘物种香蕉MaWRKY相似度较高。

WRKY家族成员在植物体内行使多种功能，当植物感知生物或非生物逆境胁迫后，可能启动一系列ZoWRKY表达，选择多种内源激素介导的信号通路，进而调控抗性基因转录，在抗性和防御反应中发挥作用。生姜中ZoWRKY成员分别有21个响应土壤湿度和19个响应青枯菌侵染，在Ⅱ-c有共同上调表达的成员，在Ⅱ-a和Ⅲ有共同下调表达的成员。高土壤湿度下呈上调表达的7个ZoWRKY主要聚类在Ⅱ-c和Ⅱ-d，结合与拟南芥同源性较高的AtWRKY8和AtWRKY17功能，推测其主要调控逆境信号通路和胁迫耐受[29]。下调表达的14个ZoWRKY主要分布在Ⅱ-a、Ⅱ-b和Ⅲ，结合同源性较高的AtWRKY40、AtWRKY6及AtWRKY54等功能，推测其主要调节防御、衰老和气孔运动等过程[30]；青枯菌侵染引起上调表达的5个ZoWRKY基因主要聚类在Ⅱ-b和Ⅱ-c，结合同源性较高的AtWRKY6和AtWRKY51的功能，推测其主要调控病原体防御和防御反应信号通路[31]。下调表达的14个ZoWRKY主要聚类在Ⅰ、Ⅱ-a和Ⅲ，结合同源性较高的AtWRKY26、AtWRKY18和AtWRKY70等功能，推测其主要参与细胞分化、防御和信号通路选择[32-33]。

4 结论

WRKY作为植物特有的转录因子家族，在生长发育、信号传导和逆境胁迫应答中发挥着重要作用，但关于ZoWRKY转录因子鉴定及逆境响应分析还未见报道。本研究借助WRKY保守域种子序列检索生姜Unigenes编码蛋白质数据库，共筛选鉴定了78个ZoWRKY成员，分为3个亚族，其中有21个和19个ZoWRKY基因分别响应不同WFPS和青枯菌侵染，参与调节逆境胁迫下生姜生长发育和对病原菌的防御反应等过程。结果有助于进一步探究ZoWRKY家族的生物学功能，解析生姜响应环境变化如何调控ZoWRKY基因转录表达，对生姜的抗性育种、提高产量及品质具有重要的意义。