赵 霞，司晶晶，赵鲲鹏，邵士俊，杨扶德,，冯金梁

（1.甘肃中医药大学药学院，甘肃兰州 730000；2.甘肃中医药大学中医临床学院，甘肃兰州 730000；3.中国科学院兰州化学物理研究所，甘肃兰州 730000；4.甘肃康乐药业有限责任公司，甘肃兰州 730000）

黄芪为豆科植物蒙古黄芪（（Fisch.）Bge.var.（Bge.）Hsiao）或膜荚黄芪（（Fisch.）Bge）的干燥根，始载于《神农本草经》，含有皂苷、多糖、黄酮等多种化学成分，现代药理学表明，黄芪具有抗炎、抗肿瘤、抗病毒、保护肾脏等作用，临床上主要用于治疗糖尿病及其并发症、心血管疾病等症。近年来，随着人们生活水平的提高，养生保健成为人们关注的焦点，黄芪作为中医传统的补虚药，其化学成分多样，药理作用显著，药性温和，受到保健行业一致的青睐。2020 年1 月，国家卫生健康委员会、国家市场监督总局公布，对黄芪开展按照传统既是食品又是中药材的物质进行生产经营试点工作，2020 年12 月，欧盟委员会发布法规，批准黄芪提取物作为新型食品投放市场，此类条例的发布进一步推进了黄芪在保健方面的开发与利用。截止2022年3 月17 日，“特殊食品信息查询平台”检索数据显示，以黄芪为原料的胶囊、口服液等保健商品多达376 种。黄芪在临床与日常保健方面的广泛应用，使其质量问题受到更多人的关注。

一直以来，黄芪真伪优劣鉴定方法主要为黄芪甲苷、毛蕊异黄酮等主要化学成分的分析与测定，而无机元素作为黄芪的重要成分之一，对其产地归属，有效成分含量均具有一定的影响。同时，相关研究表明，无机元素对作物生长发育的影响至关重要，不同生长阶段，作物对无机营养元素的需求有所不同。因此，通过对不同生长期黄芪中的无机元素进行测定，不仅可以进一步完善其质量评价体系，还可以对其生长过程中的无机肥料供给以及最佳采收期的确定提供参考。但目前有关于黄芪在相关方面的研究报道还较为少见。

甘肃陇西莲峰镇是甘肃省黄芪主产区之一，全镇中药材种植约达4.5 万亩左右，其中在元明村，杨家咀村和幸福村3 村建成千亩黄芪标准化核心示范基地。故本实验选择甘肃省定西市陇西县莲峰镇的栽培黄芪，采用电感耦合等离子体质谱法（Inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）测定不同生长期黄芪中10 种无机元素含量，通过建立无机元素图谱，运用相关性、主成分等计量方法分析其规律，探究黄芪生长过程中无机元素的累积与变化，为黄芪采收期的确定以及质量评价提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄芪药材 采自甘肃省定西市渭源县莲峰镇杨家咀村（北纬35.06°，东经104.33°）的试验田，经甘肃中医药大学杨扶德教授鉴定均为豆科植物蒙古黄芪（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao 的干燥根；65%硝酸 分析纯，德国Meker 公司；镁（Mg）、钙（Ca）、钒（V）、锰（Mn）、铁（Fe）、钴（Co）、镍（Ni）、铜（Cu）、锌（Zn）、钡（Ba）混合元素标准溶液 10 μg·mL，美国Agilent 公司。

7900 型ICP-MS 质谱仪 美国Agilent 公司；Ultra-CLAVELV 型大微波消解仪 德国Milestone 公司；BSA224S-CW 型电子天平 德国Sartorius 公司；IQ 7000 纯水净化系统 美国Millipore；G200 型切割式混合研磨仪 德国Retsch 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的采收 2020 年3 月进行黄芪的移栽后分别于2020 年6 月27 日、7 月28 日、8 月27 日、9 月26 日、10 月26 日进行黄芪样品的采收。

1.2.2 样品前处理 采收后的黄芪样品用清水冲洗干净后，分别用去离子水冲洗、阴干、粉碎、过筛（100 目），恒重后置于干燥器中备用。

1.2.3 ICP-MS 检测条件 载气为氩气，等离子体射频功率为1550 W，等离子体流速为15.0 L·min，雾化室温度为2 ℃，采样深度为8.0 mm，重复次数为3 次。微波消解条件程序如表1 所示。

表1 微波消解条件Table 1 Microwave digestion procedure

1.2.4 溶液制备

1.2.4.1 标准溶液 将10 种混合元素标准液加2%硝酸逐级稀释成不同质量系列浓度标准溶液，具体浓度见表2。

表2 10 种无机元素标准系列浓度Table 2 Standard series concentrations of ten inorganic elements

1.2.4.2 供试品溶液 精密称取不同月份采收的黄芪样品0.3000 g 置于消解罐中，每个样品平行称取3 份，加入3 mL 硝酸溶液静置30 min 后，按照表1所示微波消解条件进行消解，消解完成后将消解液转移至50 mL 容量瓶中，用少量超纯水冲洗消解罐，定容，同时做试剂空白。

1.3 数据处理

本论文中的数据均为3 次重复处理结果的平均值，利用Microsoft Excel 2010、SPSS 26.0 与SIMCA 14.1 软件对数据进行统计分析。热图采用Hiplot（https://hiplot.com.cn）网络平台绘制，数据表现形式为“平均值±标准差”，统计差异水平利用单因素方差分析（One-way ANOVA）中的Duncan 多重比较检验，相关性分析采用皮尔逊（Pearson）相关分析法进行。

2 结果与分析

2.1 方法学考察结果

2.1.1 标准曲线绘制 精密吸取标准溶液，取相对原子质量相近的元素为内标溶液，在1.2.3 所示条件下进样进行含量测定，结果如表3 所示，各元素值均大于0.999，表明其线性关系良好。

表3 10 种无机元素线性关系考察结果Table 3 Results of linear relationship investigation of ten inorganic elements

2.1.2 精密度 取同一黄芪样品消解液在1.2.2 所示条件下连续进样6 次，根据测量值计算各元素质量浓度响应值RSD 值。各元素RSD<2%，表明仪器精密度良好。

2.1.3 重复性 精密称取同一黄芪样品6 份，每份各0.3000 g，分别按照表1 和1.2.2 所示条件进行消解和测定，根据测量值计算各元素质量浓度响应RSD 值。各元素RSD<4%，表明实验的重复性良好。

2.1.4 稳定性 取同一黄芪样品消解液在1.2.2 所示条件下分别于0、2、4、8、10、12、24 h 时进样测定，根据测量值计算各元素质量浓度响应值的RSD值。结果表明各元素RSD<4%，表明仪器的稳定性良好。

2.1.5 加样回收率 精密称取已知各元素含量的黄芪样品0.3000 g，每份样品平行3 份，加入各元素标准液适量，分别按照1.2.2 所示条件进行消解和测定。结果显示，各元素加样回收率在90.10%～108.33%之间，回收率良好，且RSD<4%，表明该方法稳定可行。

2.2 不同生长期黄芪无机元素含量测定结果

10 种元素含量测定结果如表4 所示。不同生长期黄芪样品中测得的10 种元素含量差异较大，其中Mg、Ca、V、Mn、Fe、Ni 和Cu 元素含量均在10 月份时显著高于其他生长时期（<0.05），8 月时其含量均显著低于其他时期（<0.05）；Co 元素含量在10 月份时达到最大值，但与7 月与9 月时的样品无显著性差异，Zn 元素在9 月时其含量显著高于其他采收期（<0.05），7 月时含量显著低于其他生长期（<0.05），Ba 元素在6 月时含量显著高于其他生长期（<0.05），8 月为其含量最小的生长期。Mg、Ca、V、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ba10 种元素10 月份含量相较于6 月份分别增加了26.18%、34.15%、40.97%、8.33%、92.36%、77.45%、−19.27%、10.95%、32.49%、−6.66%，结果表明，除Ni 元素与Ba 元素外，黄芪对其他元素均有富集作用，对Fe 元素的富集效果最为明显。为了更直观的表示不同生长期黄芪中无机元素含量的差异，对10 种元素含量数据进行标准化处理后绘制热图，结果如图1 所示，同种元素在不同生长期内含量具有较大的差异，基于欧式距离对其进行聚类后发现，7、8 月样品可以聚为一类，6、9 月样品可以聚为一类，10 月份样品单独为一类，聚为同一类的样品所在生长期在元素含量上具有一定的相似性。

图1 10 种无机元素热图Fig.1 Heat map of ten inorganic elements in Astragalus membranaceus

表4 不同生长期黄芪样品中10 种无机元素含量（mg·kg−1）Table 4 Contents of ten inorganic elements in Astragalus membranaceus samples at different growth stages (mg·kg−1)

2.3 元素特征图谱的绘制

为了进一步观察10 种元素累积过程，将Mg、Ca、Fe 含量缩小1000 倍，Mn、Cu、Zn、Ba 含量缩小10 倍，其他元素保持不变后制作特征图谱图，结果如图2 所示，10 种元素含量的累积均为先降后升的动态变化趋势，6 月份元素含量均处于较高的水平，然后开始下降，除Cu 元素在7 月份有最低含量外，其他元素均在8 月份时元素含量最低，9 月份开始回升，10 月份又达到一个高峰。结果表明，黄芪根部在不同生长时期对无机元素的富集效果不同，9～10 月为黄芪根部无机元素大量累积的生长期。

图2 不同生长期黄芪无机元素含量变化Fig.2 Changes of inorganic elements in Astragalus membranaceus at different growth stages

2.4 10 种无机元素间的相关性分析

植物的生长发育是多种营养元素相互作用的结果，各类无机营养元素也会在植物体内相互协助与制约帮助植物健康的生长，如植物金属锌铁转运蛋白在调节植物体内镉元素的累积过程中起关键作用，避免植物遭受镉元素毒害。本实验对10 种元素进行相关系分析，结果如表5 所示，Mg 与Ca、Mn；Ca 与Mn、Fe、Ba；V 与Mn、Ba；Ni 与Ba 元素之间均存在显著性相关关系，V 与Ca、Fe；Ni 与Ba 元素均存在极显著性相关关系，无机元素的相关性强表明一种元素含量因某种因素发生变化时与其相关的元素含量也会发生相应的变化。因此，在调节有益元素含量增长的同时也要注意一些重金属元素对身体造成的危害。

表5 不同生长期黄芪样品10 种无机元素相关性分析结果Table 5 Correlation analysis results of ten inorganic elements in Astragalus membranaceus samples at different growth stages

2.5 不同生长期黄芪的综合评价

为了对不同生长期黄芪中所含无机元素进行综合性评价，对不同生长期样品中10 种无机元素进行主成分分析，结果如表6 所示，前两个成分特征值均大于1，且其累积方差贡献率达到了92.132%，表明这两个成分具有较强的代表性。由各生长期样品得分与成分累积方差贡献率和计算其综合得分F，结果如表6 所示，10 月份样品综合得分排名为第一。结果表明，从无机元素层面来说，10 月份黄芪药材质量较优。

表6 不同生长时期黄芪主成分分析综合排名Table 6 Comprehensive ranking of principal component analysis of Astragalus membranaceus at different growth stages

2.6 不同生长期黄芪样品差异性元素筛选

为分析不同生长期黄芪样品的主要影响元素，在主成分分析的基础上，对其进行正偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），根据变量重要性投影（VIP），筛选不同生长期黄芪差异性元素，其中VIP 值越大表明其对分类的贡献率越大，当VIP>1 时，说明该变量为分类的关键因素，分析结果如图3 所示。10 种元素中Zn、Ni、Cu、V 四种元素VIP>1，表明此4 种元素可作为特征元素对黄芪的生长进行鉴别。

图3 不同生长期黄芪样品 OPLS-DA 得分图Fig.3 OPLS-DA score of Astragalus membranaceus samples at different growth stages

3 结论与讨论

不同时期各无机营养元素的积累与黄芪生长发育密切相关，由相关研究可知，从移栽期到6 月，为黄芪的移栽出苗期，此阶段黄芪根部会吸收土壤中大量养分以满足其快速生长发育，故在6 月份时，各无机营养元素会达到一个高峰；6～8 月为花果期，植株的快速生长，根部吸收的各类营养成分需要供应地上部分开花、结果，无机营养元素也随之下降，8 月份时，各营养元素含量最低；随着花期的结束，8 月中旬至10 月中旬，为黄芪的根茎增粗期，主要营养元素又向根部积累，无机营养元素也又一次达到了一个高峰，本研究中无机元素含量在其生长期中的变化符合黄芪的生长的供应需求，主成分综合排名表明，10 月下旬时，黄芪根部各类营养元素含量累积到了最大值，且根据相关报道可知，黄芪产量、皂苷等有效成分也在相同时期达到其最大积累量，综合考虑各方面因素，10 月中旬，可以作为栽培黄芪的最佳采收期。正偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）发现，Zn、Ni、Cu、V 四种元素与黄芪的生长密切相关，Zn、Ni、Cu 元素均为植物生长发育必需的矿质元素，Zn 作为植物多种酶和重要蛋白结构的辅助因子和活化剂，缺锌会导致其生长素含量下降，进而造成植株矮小、生长缓慢等一系列生理问题，施用Zn 肥不仅可以促进作物生长，还可以通过Zn-Cd 拮抗作用缓解Cd 毒害。Ni 是脲酶所必需的元素，脲酶的缺乏将导致植物叶片坏死损伤，营养生长期镍主要分布于叶和芽中，生殖生长期绝大部分镍会从叶和芽转移到生殖器官；Cu 是植物叶绿体中质体蓝素的组成成分，参与光合电子传递过程，不同物种地上部和地下部的Cu 含量及转移能力存在较大差异；V 元素作为为人体必需元素之一，尽管目前还没有确定是植物生长所必需的营养元素，但相关研究表明，适量的V 元素可以促进作物生长，促进植物的固氮、固氯作用，针对此4 种元素与黄芪生长发育的密切关系与其在植物体内的重要作用，可以为黄芪无机肥料的配比与供给提供参考。