钱 蕾，于海燕，娄新曼，田怀香,

（1.上海应用技术大学香料香精技术与工程学院，上海 201418；2.上海牡丹香精香料有限公司，上海 201210）

可可粉因其特有的风味（如巧克力、坚果香、花香、果香等），被广泛应用于烘焙、冰淇淋等食品加工产业。近十年，全球可可消费的平均增长率为3%，而随着消费升级发展中国家对可可的需求增长迅速。以中国为例，2010 年可可及可可制品进口贸易额为4.21 亿美元，到2021 年进口额达10.45 亿美元，年均增长率达8%以上，远高于全球平均水平。全球60%可可豆产自西非，但其产量及品质受气候变化、种植技术以及病虫害的限制。面对原料供应限制以及需求增长，提高可可粉的质量并充分利用可可粉有助于相关食品工业和健康产品再加工。

在生可可豆中，内源酶的存在，如天冬氨酸蛋白酶协同羧肽酶作用，使可可豆水解形成具有可可特征香味的前体物—还原糖、氨基酸及短链肽。经过烘烤和干燥处理后，可促进氨基酸、肽与糖发生Maillard 反应，从而形成可可特征风味的香气物质。其中，2,6-二甲基吡嗪（OAV 为0.2-1.3）、2-乙基-6-甲基吡嗪（OAV 为0.3～4.8）、2,5-二甲基-4-羟基呋喃酮（OAV 为74.3～186.5），呈现焦甜烘烤香气，2-甲基丁醛（OAV 为3～14），醛类及内酯类化合物具有乳脂香气，对整体巧克力风味有重要贡献。目前，研究者已开展一系列利用生物化学技术优化可可风味的研究。Moulay 等利用蛋白酶和糖化酶处理可可粉，经过烘烤后可可粉中吡嗪类烘烤香化合物的浓度显著上升。Voigt 等模拟重组可可豆内氨基酸混合物与糖进行美拉德反应，并进一步论证氨基酸和寡肽共同产生了可可的特征风味。然而，在自然环境中，内源性蛋白酶的酶解过程通常需要较长的时间（24～168 h），且得率相对较低。利用酶解、发酵等生物技术对天然动植物进行处理，其条件温和、可控，且制备出的香料属天然等同物，相较于其他香料制备方法更有优势。

基于内源性酶在风味优化应用中的局限性，为了拓展和考察酶解联合高温工艺优化可可粉风味的可行性，本实验拟采用5 种蛋白酶对脱脂可可粉酶解过程游离氨基酸的影响进行研究，并进一步采用顶空-气相色谱-质谱联用（headspace gas chromatography mass spectrometry，HS-GC-MS）结合香气活度值（odor activity value，OAV）研究反应温度对可可挥发性物质的影响。基于OAV 和感官评价，建立偏最小二乘（partial least squares，PLS）模型对联合作用进行验证，为进一步优化可可的风味品质研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

脱脂可可粉（L.）林氏香精公司；天冬氨酸型胃蛋白酶（1×10U/g）、菠萝蛋白酶（100×10U/g）、木瓜蛋白酶（100×10U/g）庞博生物科技有限公司；酸性蛋白酶（50×10U/g）河南万邦实业有限公司；风味蛋白酶（30×10U/g）东恒华道酶制剂公司；茚三酮、庚酸甲酯 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠·二水合、无水葡萄糖、果糖 上海国药试剂公司。

SW23-40 型恒温振荡水浴槽 优莱博技术有限公司；Biofuge Stratos 台式高速冷冻离心机 赛默飞科技公司；Cary60 型紫外-可见光分光光度计、7697A顶空-7890B-5977A 色谱质谱联用仪 安捷伦科技有限公司；磁力加热盘 艾卡仪器设备有限公司；pH 计 梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 可可粉酶解试验 为避免可可脂在含水的酶解过程水解生成其他小分子，选用脱脂可可粉以1:15（g:mL）加水或磷酸盐缓冲液，磷酸缓冲液用于为蛋白酶酶解提供适宜的pH 条件，天冬氨酸酶和酸性蛋白酶需要加缓冲液，分别配制pH 为2.0 和3.5 的磷酸缓冲液，另3 个选择加水，加水后可可粉与水混合物的pH 为6.4。混合均匀，分别加入天冬氨酸酶、酸性蛋白酶、风味酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶，温度和pH 根据所添加酶的最适宜酶解条件进行设置，如表1 所示。将混配料液置于水浴振荡锅中酶解10 h，沸水浴10 min 灭酶。

表1 不同酶的酶解条件Table 1 Enzymatic hydrolysis conditions of different enzymes

1.2.2 总游离氨基酸测定 取可可粉酶解液（0.2 mL）、pH6 磷酸盐缓冲溶液（0.5 mL）和茚三酮溶液（0.4 mL,2%乙醇溶液）于50 mL 比色管中，沸水浴加热15 min，水浴冷却，并加入去离子水定容至50 mL 充分混合。避光放置15 min 后，4500 r/min 离心8 min 取上清液。采用紫外-可见分光光度计在570 nm 波长处测定样品吸光度。以丙氨酸为标准溶液，根据标准曲线y=0.7273x−0.2492（=0.995）计算得出酶解液中氨基酸浓度（mmol/L）。每个样品重复测定3 次。

1.2.3 可可粉酶解液的高温反应试验 根据Maillard反应产香原理，将可可粉酶解液作为原料，与糖混合后加热反应，形成具有特征香气的Maillard 反应产物。35 mL 耐压反应管中加入经过风味蛋白酶处理的可可粉酶解液15 g 和糖1.5 g（葡萄糖:果糖=3:7），油浴温度范围90～180 ℃，混合搅拌2 h。结束后水浴冷却，4000 r/min 离心8 min，收集上清液，待风味物质鉴定及OAV 计算。

1.2.4 酶解联合高温处理反应物的制备 将5 种酶处理的可可粉酶解液按1.2.3 进行高温反应，油浴温度为150 ℃，待感官评价及风味物质鉴定。对照样为未添加任何酶，加去离子水55 ℃水浴加热3 h，后续高温反应与酶解液一致。

1.2.5 感官评价 对1.2.4 可可联合处理反应物进行感官评价。感官评价小组由6 位受过专业训练的人员组成，通过评估标准样品的香气进行培训。可可感官描述词参照欧洲可可协会出版的可可质量要求，如表2 所示。为了屏蔽固定序列相邻样品间的相互影响，评测时，将受试样品根据拉丁方阵的顺序进行编号。各项指标按照感受强烈程度1～10 打分，评价总分=嗅觉+0.2×味觉，总分100。

表2 感官描述词和评分Table 2 Sensory evaluation descriptions

1.2.6 顶空-气相色谱质谱联用风味物质鉴定 顶空-气相色谱质谱联用风味物质分析方法参照朱宏等和Mohamadi Alasti 等的方法并做修改。

1.2.6.1 顶空条件 取可可粉酶解高温处理反应物1.0 g 和20 μL 浓度为4.35 mg/mL 庚酸甲酯（内标）于20 mL 顶空瓶中，加盖密封，放入进样盘。样品在90 ℃下平衡30 min，进样过程中捕集器和传输线温度分别为105 和110 ℃，进样时间为1 min。

1.2.6.2 色谱条件 HP-5 色谱柱：30 m×0.25 mm×0.25 μm；载气He 气流速度为1.2 mL/min。柱温35 ℃起始，保持3 min，3 ℃/min 上升至160 ℃，再以10 ℃/min 上升至200 ℃，保持2 min；分流比10:1。

1.2.6.3 质谱条件 电离方式EI；电子能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；传输线温度：250 ℃；扫描质量范围：35～500。

1.2.6.4 定性、定量分析 挥发性化合物的质谱与Wiley275、Nist11、Flavor 2 标准图谱库串联检索，保留质谱匹配度≥80；以相同色谱条件下正构烷烃（C～C）出峰保留时间，计算保留指数RI 值，并与NIST 数据库的RI 值进行比对，两种方法作为判定依据。挥发性化合物的定量采用内标（庚酸甲酯）半定量法，按式（1）计算出各成分相对含量（质量分数）。

式中：C表示该化合物的质量分数（μg/g）；A表示该成分的峰面积；C表示内标物的质量分数（μg/g）；A表示内标峰面积。总共进行3 次重复试验，数据取3 次试验平均值。

1.3 数据处理

采用Excel 2019、Origin 8 进行数据图表的基本处理，IBM SPSS 20 进行检验及Waller-Duncan 方差分析（显著性水平0.05），SIMCA 14.1 进行偏最小二乘分析，聚类树图通过R studio 制作。

2 结果与分析

2.1 不同蛋白酶对可可粉水解程度的影响

可可粉在经历不同蛋白酶作用后，氨基酸浓度出现明显差异（<0.05）。氨基酸被视作形成风味物质的重要前体物，为确保酶解充分，实验时设计足够长的酶解时间，定时取样测定氨基酸浓度，将达到浓度峰值所用的时长作为酶解时间。由图1 可知，5 种蛋白酶酶解时间不同，时间最短的是风味蛋白酶，水解时间3 h，时间最长的是菠萝蛋白酶，为8 h。比较游离氨基酸总量，对可可粉酶解作用由大到小排序为：风味蛋白酶>菠萝蛋白酶>天冬氨酸蛋白酶>木瓜蛋白酶>酸性蛋白酶。天冬氨酸酶和酸性蛋白酶属酸性蛋白酶，水解温度为40 ℃，得到氨基酸含量分别为0.09 和0.06 mmol/g；风味蛋白酶、菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶属中性蛋白酶，水解温度为55 ℃，得到氨基酸含量分别为0.20、0.14 和0.08 mmol/g。酶解作用差异的原因可能与酶的特异性有关，如菠萝蛋白酶和天冬氨酸酶选择性水解7S 大豆球蛋白，木瓜蛋白酶选择性水解11S 大豆球蛋白，而可可豆中7S 球蛋白含量高于11S，因此菠萝蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶作用后氨基酸浓度更高。Rohstus 等测定生可可豆的氨基酸含量为5～25 mg/g；Kadow 等在35 ℃观察可可发酵5 d，每克可可降解出的游离氨基酸含量范围5.7～25.2 mg，氨基酸摩尔质量为70～180 g/mol，换算后范围在0.03～0.36 mmol/g，本文酶解液中游离氨基酸含量为0.06～0.20 mmol/g，与文献范围符合。

图1 5 种蛋白酶酶解可可粉后氨基酸含量变化关系Fig.1 Changes in the concentration of free amino acid from five enzymic hydrolysates

2.2 高温处理对可可风味物质的影响

Maillard 反应物的香气属性取决于温度和反应时间，除了巧克力制作，可可粉还可用作饮料冲剂以及烘焙产品的添加，这些实际应用场景的温度在100～200 ℃。

本文选择2.1 中酶解作用最显著的风味蛋白酶，考察其可可粉酶解液在90～180 ℃温度中挥发性物质的变化，试验证明高温加热有利于挥发物种类和含量的提升，一共检测出44 种风味物质，不同温度条件下分别鉴定出18（90 ℃）、15（100 ℃）、22（120 ℃）、32（135 ℃）、38（150 ℃）和34（180 ℃）种。特征型挥发物的变化如下：90 和100 ℃产物的差异较小，奶油香的2,3-丁二酮（从0.35 μg/g 增加至1.13 μg/g）在整个温度范围始终存在，与文献[30]中醛酮类物质烘烤前后浓度由0.13 μg/g 提升至7.82 μg/g 变化一致。具有果香的2-甲基丁醇（从0.03 μg/g 增加至0.19 μg/g）和巧克力香的2-甲基丁醛（2.03 μg/g 增加至16.65 μg/g）在120 ℃产物中开始累积，135 ℃产物中开始出现甲酸（从0.50 μg/g 增加至5.44 μg/g）、乙酸（从0.23 μg/g 增加至23.83 μg/g），小分子酸为Maillard 反应产物；150 和180 ℃产生了巧克力香的甲基吡嗪（从0.03 μg/g 增加至0.10 μg/g）、糠醇（0.11 μg/g 增加至0.43 μg/g）以及焦甜香的糠醛（从0.07 μg/g 增加至24.10 μg/g）等杂环类物质，天然存在于可可、咖啡、肉类中，被视作可可香精的重要成分，整体焦甜香更浓郁。高温条件对挥发物的影响，推测是酶解后的氨基酸在烘烤过程与糖发生Maillard 反应，生成更丰富的挥发物。如图2C～2E中，2,3-丁二醇、糠醇、2-甲基丁醇在135 ℃以上出现浓度减少的趋势（如图2F），醇类拥有甜蜜和花香，它既是醛的前体，又可参与酯化反应，伴随着烘烤温度提升，一部分转化成醛类或者酯类，进一步增加样本的焦甜香味物质。

图2 不同反应温度的可可粉酶解液挥发物变化图Fig.2 Changes of cocoa enzymic hydrolysates volatile compounds at different temperature

不同温度处理物中鉴定出的44 种化合物，结合质量分数及其对应阈值，计算OAV（OAV，各成分的浓度与阈值之比）。其中，OAV>1.0 的化合物一共有20 种，经标准化处理后以聚类树图的方式讨论温度对样品风味的影响。

如图3 所示，共有三类变化趋势：第一类在90～150 ℃物质含量没有显著变化（>0.05），180 ℃产物中含量显著提高（<0.05），包括乙酸、己酸甲酯、糠醛、5-甲基糠醛等，表现出酸、果香和焦甜，糠醛和5-甲基糠醛为焦糖化和美拉德反应中的特征物质；第二类随着温度升高，含量逐步增加，且150～180 ℃增量趋势放缓，包括丁二酮、2-甲基丁醛、2-甲基丁醇和吡嗪，天然存在于烘烤后可可豆中，表现出巧克力和奶油香气；第三类随着温度升高，含量先增多后减少且在150 ℃含量最高，包括苯乙醛、壬醛和2,3-二甲基-5-乙基吡嗪，表现出花果香和巧克力特征香。巧克力特征香的物质集中于第二、三类，150 和180 ℃产物的巧克力特征香更丰富，与文献[10]可可豆烘烤温度大于140 ℃各挥发物浓度提高的现象一致。当温度达180 ℃时，吡嗪的OAV 减弱而具有洋葱味的二甲基二硫醚的OAV 显现，各挥发物对香气贡献从OAV 判断不及150 ℃样品。通过高温处理可可粉酶解液，温度达150 ℃能较好地发挥样品风味及其整体香气效果，使整体巧克力风味最佳。

图3 不同反应温度对可可挥发物OAV 的聚类树图Fig.3 Tree graph of different temperature on the volatile OAV of cocoa

2.3 酶解联合高温反应物的挥发性物质分析

利用HS-GC-MS 方法对5 种可可粉酶解液经150 ℃高温处理2 h 后挥发性化合物进行研究。表3总结了HS-GC-MS 分析结果。通过质谱库比对及保留指数，共鉴定出48 种挥发性成分，其中杂环14 种、酮10 种、酸9 种、醇6 种、醛5 种、酯4 种，其中有26 种出现于相关可可粉风味分析的文献中。与未经酶解的高温处理样品（12 种）相比，酶解处理后（29 种以上）挥发性化合物更加丰富，而不同酶解样品的挥发物种类保持一定共性，共有化合物为15 种，占总数的1/3。其中，杂环物质的数量最多，为呋喃类和吡嗪类。不同酶处理的可可粉酶解液经高温处理后各类香气种类和质量分数上存在显著差异（<0.05），可能原因是水解氨基酸组成及其加热时Maillard 反应形成挥发物差异引起的。呋喃主要由糖自降解和焦糖化过程中生成，2-乙酰基呋喃具有坚果烤甜香，5 个反应样中均检测到，风味酶处理样中含量最高（133.79±6.55）μg/g。吡嗪类物质由-二羰基化合物与氨基酸发生Strecker 降解生成，阈值低，香气作用强。对于2,6-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪和四甲基吡嗪3 种吡嗪化合物的总量，天冬氨酸酶处理样中最高（2.53±1.51）μg/g，赋予产品巧克力风味。糠醇和糠醛、苯乙醇和苯乙醛两组化合物成对存在，醇类贡献花果香气，它既是醛的前体，又参与酯化反应，因此随着反应进程推进，醇含量逐步减少，而醛含量不断累积。具有强烈花香的苯乙醛，风味酶处理样中最高含量（31.70±22.42）μg/g，是对照样品中含量（2.87±0.03）μg/g 的10 倍，原因是其在反应过程中大量的苯乙醇转化为苯乙醛，这也解释了苯乙醇在对照样中含量最高（14.42±0.98）μg/g。酸性酶处理样中酸类物质含量丰富，主要是小分子乙酸，但乙酸的阈值较高且易挥发，对整体香气作用较弱。此外，庚酸的存在为样品增加乳脂的香味。菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶处理样产物种类最丰富，具有菠萝香的庚酸乙酯为菠萝蛋白酶解物独有的，但挥发物总量不具优势，从水解出氨基酸总量的劣势侧面解释了菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶单一作用时的不足，若进一步与多种酶协同作用，既能弥补水解程度不足的缺点，还能发挥产物丰富的优势。

表3 可可联合处理反应物的挥发物HS-GC-MS 分析Table 3 Contents of volatile compounds from cocoa combined reactants by HS-GC-MS

2.4 可可联合处理反应物的感官评价

可可粉经酶解和150 ℃高温处理2 h 后，其感官评价如图4 所示。与未经酶处理的对照样相比，巧克力、奶香、焦糖、辛香、烟熏5 项指标有极显著差异（<0.01），花香、坚果和木香感官指标有显著差异（<0.05）。其中，风味蛋白酶组在巧克力、奶香、坚果香气方面表现最佳，酸性蛋白酶的酸味、辛香最显著，菠萝蛋白酶的焦糖和甜味表现更好。综合比较反应物的总体风味，风味蛋白酶组的总分最高。

图4 可可联合处理反应物的感官评价Fig.4 Sensory evaluation on enzymatic hydrolysis combined with high temperature of cocoa

2.5 PLS 分析可可联合处理反应物与感官属性的关系

为了探究不同反应物的感官属性和挥发性风味物质的差异，以其挥发物的OAV 为自变量，通过对5 种联合处理可可粉的感官评价，各感官属性得分作为因变量进行偏最小二乘分析。利用Simca 软件的PLS 模块对风味成分和感官属性进行相关性分析，前三个主成分共计解释了88.8%的差异，分析结果具有代表性。经不同联合处理的可可粉，感官属性预测分析如图5 所示。

图5 不同酶处理样品与感官属性的PLS 图Fig.5 Partial least squares regression of cocoa samples and sensory indicators

比较分析感官属性分布，联合处理样品与未经酶处理的对照样有显著差异（<0.05），苦、酸等负面感受的感官属性处于第三象限，可可特征香属性分布于第四象限。5 种酶解样品中木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶距离对照样最近，在酶解过程释放游离氨基酸较少，导致其风味与对照样较接近，整体香气除具备一定可可粉特征香气外，还带有一定的果酸味。天冬氨酸酶与酸性蛋白酶的风味接近，具备一定烟熏辛香，还带有明显的油脂味；风味蛋白酶样品与对照样香气感官差异最明显，与巧克力特征香有更强的相关性，坚果香、奶香作用显著，同时果甜香更丰富，果香也是突出于普通可可粉的风味优势，这也与感官评价的结果相一致。

3 结论

本文深入探究了酶解联合高温处理对可可粉风味特性的影响。蛋白酶解作用提升了游离氨基酸的浓度，因蛋白酶的特异性对脱脂可可粉的酶解效果造成差异，风味蛋白酶、菠萝蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶处理后游离氨基酸浓度分别提升至0.20、0.14、0.09、0.08 和0.06 mmol/g。150 ℃以上的高温处理使游离氨基酸与还原糖发生Maillard 反应，促进风味物质的生成，表现出花果香和巧克力特征香。由偏最小二乘模型模型验证，酶解联合高温处理有助于提高样品的奶香味和花果香，经风味蛋白酶处理3 h 的可可粉在150 ℃加热2 h，既保有其本身的巧克力、焦甜和奶油香气，同时额外的花果香使香气更加丰富。由此可得，酶解工艺有助于提高可可粉中游离氨基酸的含量，高温促使可可特征风味的形成，酶解联合高温处理对可可风味的优化及香精制备工艺提供了理论以及和技术支持。