王玉婷 梁诗雨 谢宇娟 李舒展 徐 怡 王佳慧 赵铁建 郑 洋

基于网络药理学研究扶正化瘀方抗肝纤维分子机制

王玉婷 梁诗雨 谢宇娟 李舒展 徐 怡 王佳慧 赵铁建 郑 洋

（广西中医药大学赛恩斯新医药学院，广西 南宁 530222）

目的：基于网络药理学方法分析扶正化瘀方抗肝纤维化分子机制研究。方法：利用OMIM、GeneCards等数据库获得肝纤维化相关靶点，采用Venn图对扶正化瘀方活性成分作用靶点和肝纤维化相关靶点进行交互处理；利用String数据库和metascape数据库对交互靶点进行基因和信号通路注释，明确扶正化瘀方抗肝纤维化的分子机制。结果：选择了扶正化瘀方中的抗肝纤维化成分：有桃仁中的苦杏仁苷、丹参中的丹酚酸B和虫草菌丝中的虫草等。其中丹参主要化学成分为水溶性成分（丹参素、丹酚酸A及B、迷迭香酸、原儿茶酸、原儿茶醛等）和脂溶性成分（二氢丹参酮I、丹参酮IIA等）。丹参酮类是丹参的主要脂溶性成分，主要包括TanⅡA、隐丹参酮（cryptotanshinone，CPT）、丹参酮Ⅰ、二氢丹参酮等。TanⅡA是含量最多、目前研究最为深入的丹参酮。TanⅡA属二萜醌类化合物，具有抗炎、抗肿瘤、心血管保护等多种活性。通过TCMSP数据库对扶正化瘀方的这些活性成分进行筛选，并获得扶正化瘀方活性成分作用靶点。将获得的作用靶点，通过UniProt数据库将其转换为基因名，并将其导入String数据库获得作用靶点互作数据，利用Cyctoscape3.4.0构建互作网络。通过OMIM、GeneCards数据库获得肝纤维化相关靶点蛋白，对化合物靶点与肝纤维化靶点进行交互处理，获得重叠靶点。结论：体现了扶正化瘀方多靶点-多通路的作用特点，其所作用的多条通路均存在关联性，为进一步研究提供了良好的基础。

扶正化瘀方；网络药理学；肝纤维化；信号通路；HIF

引言

扶正化瘀方是由上海中医药大学针对肝纤维化血瘀研制，属于治疗肝纤维化的中药复方，由丹参、冬虫夏草、桃仁、松花粉、绞股蓝、五味子等6味中药组成，其功效为活血祛瘀、益精养肝。用于乙型肝炎纤维化属瘀血阻络、肝肾不足证者、肝炎后肝硬化正气虚损、血瘀阻络等疾病[1]。常表现为肋下痞块（肚中可摸到硬块，因脾肿大而引起）、胁肋疼痛、面色晦暗（面部皮肤没有光泽、血色，出现萎黄、枯黄、暗淡、污垢色等）、或见赤缕红斑（蜘蛛痣）、腰膝酸软、疲倦乏力、头晕目涩、舌质暗红或有瘀斑、苔薄或微黄、脉弦细等。该方中抗肝纤维化成分有桃仁中的苦杏仁苷、丹参中的丹酚酸B和虫草菌丝中的虫草等[1]。其中丹参主要化学成分为水溶性成分（丹参素、丹酚酸A及B、迷迭香酸、原儿茶酸、原儿茶醛等）和脂溶性成分（二氢丹参酮I、丹参酮IIA等）。丹参酮类是丹参的主要脂溶性成分，主要包括TanⅡA、隐丹参酮（cryptotanshinone，CPT）、丹参酮Ⅰ、二氢丹参酮等[2]。其中，TanⅡA是含量最多、目前研究最为深入的丹参酮。TanⅡA属二萜醌类化合物，具有抗炎、抗肿瘤、心血管保护等多种活性。该药针对肝纤维化正虚血瘀的基本病机而设，方中丹参养血活血为君药；冬虫夏草补虚损、益精气，桃仁助丹参活血化瘀，共为臣药；松花粉益气润燥，绞股蓝清热解毒，同为佐药，现代药理研究更发现绞股蓝含有比人参更高浓度的人参皂甙，可协助补气；五味子味酸为引经使药。诸药合用，活血化瘀，益精养肝，从而达到抗肝纤维化的效果。

肝星状细胞是肝周细胞，是正常肝脏本身固有的细胞[3]。但是肝纤维化形成过程中，肝星状细胞被激活，在肝内的正常比例被打破，出现增殖，细胞自噬能力、迁移能力、合成胶原能力、炎症反应等被激发，产生大量细胞外基质（纤维组织）在肝内沉积，导致肝纤维化和肝硬化[4]。扶正化瘀方治疗肝纤维化正是通过缓解肝细胞的炎症反应同时在肝纤维化形成的过程中抑制肝星状细胞活化、增殖，从而发挥治疗作用，促进活化肝星状细胞的凋亡、促进细胞外基质的降解、抑制血管新生而减少纤维间隔、改善微循环、抑制肝星状细胞的收缩，以及调整免疫功能等[5]。目前已经明确的作用机制不下十二种，它们协同作用、互相促进，共同达到抗肝纤维化的目的。临床研究也证实扶正化瘀方治疗肝纤维化疗效确切，能明显抑制肝纤维化的进一步发展，提高患者生存的几率。

扶正化瘀方抗肝纤维化药理机制研究已经深入到分子生物学水平，对其作用机制研究主要在某些靶点、某条通路方面，并未能揭示其系统的药理作用机制。网络药理学的研究方法在不断发展与完善，通过运用大数据和网络分析等手段研究扶正化瘀方中多成分的作用药理机制，证明扶正化瘀方“弱抑制-多靶点”的科学内涵。网络药理学以“整体性”和“系统性”为特点，其特点表现在探索药物与疾病之间的大脉络关系，这与中医药的治疗原则相符。本研究拟基于网络药理学思路与方法，研究扶正化瘀方中有效成分、靶点、通路之间的关系，探讨其可能的抗肝纤维化作用机制，运用网络药理学的研究方法对扶正化瘀方抗肝纤维化的作用机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 软件与网站

TCMSP数据库（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）[6]；UniProt数据库（http://www.uniprot.org）[7]；String数据库[8]；OMIM[9]、GeneCards数据库[10]；Venn图软件；metascape数据库[11]；cytoscape可视化软件。

1.2 扶正化瘀方的活性成分以及其作用靶基因的筛选

通过运用网络药理学的研究方法对扶正化瘀方的活性成分进行筛选，并获得其活性成分的作用靶点。首先，利用TCMSP数据库（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）筛选并确定出扶正化瘀方的活性成分以及作用靶点；接着，通过利用UniProt数据库（http://www.uniprot.org）对扶正化瘀方作用靶点进行进一步的验证。

1.3 构建肝纤维化疾病相关作用靶点分子信息库

使用OMIM、GeneCards数据库，通过检索“hepatic fibrosis”预测并筛选出肝纤维化对应的作用靶点信息以及相关分析。

1.4 构建重叠靶点的互作网络

对扶正化瘀方活性成分作用靶点以及肝纤维化靶点信息库进行交互处理，获得扶正化瘀方抗肝纤维化的作用靶点。通过利用String数据库构建扶正化瘀方-肝纤维化疾病活性成分作用靶点互作网络并导入cytoscape可视化软件绘图。接着用Venn图软件对扶正化瘀方活性成分作用靶点和肝纤维化相关作用靶点进行交互处理，获得重叠靶点蛋白。利用metascape数据库对重叠靶点进行基因功能和信号通路的注释。

2 结果

2.1 扶正化瘀方活性成分—靶点网络

通过查阅文献检索发现扶正化瘀方中主要的活性成分包括：丹酚酸B、虫草酸、虫草素、苦杏仁苷、聚-β-羟丁酸、绞股蓝提取物、五味子素等。此7种活性成分为研究对象，其基本信息见表1。根据TCMSP数据库进行检索查找扶正化瘀方的靶点基因共计608个，其中丹参的靶点基因140个，冬虫夏草的靶点基因73个，桃仁的靶点基因116个，松花粉的靶点基因60个，绞股蓝的靶点基因194个，五味子的靶点基因25个。扶正化瘀方7种活性成分对应131个靶基因，其主要活性成分—靶点网络见图1。

表1 扶正化瘀方的主要活性成分信息表

图1 扶正化瘀方主要活性成分—靶点网络

2.2 相关靶点数据库对比分析

根据OMIM、GeneCards数据库检索关键词“hepatic fibrosis”共计筛选出1573个疾病相关靶点基因，根据Relevance（相关度）计算出中位数，在GeneCards数据库取前1500个靶点，在OMIM数据库取前73个靶点组建相关靶点数据库。对扶正化瘀方靶点和肝纤维化相关发病机制靶点进行对比验证，得出扶正化瘀方中与肝纤维化发病机制相关作用靶点基因125个，包括NR3C2、AR、BCL2、ADRB2等。并构建扶正化瘀方成分靶点与肝纤维化相关发病机制靶点Venn图，见图2。

图2 扶正化瘀方成分靶点与肝纤维化相关发病机制靶点Venn图

2.3 扶正化瘀方靶基因—肝纤维化靶基因PPI网络的构建

将扶正化瘀方和肝纤维化疾病的靶点基因进行规范处理后得出共有靶点基因125个，包括NR3C2、AR、BCL2、ADRB2等。将其导入STRING网站，并选择人类基因类型（homo sapiens）且设置最小关系值≥0.9，生成药物—疾病共有靶点PPI网络，将结果输入cytoscape3.8.2软件进行分析，从而获得PPI网络共有节点117个，605条边，根据Degree值排名前七位的靶蛋白STAT3、TP53、RELA、AKT1、MAPK1、TNF、JUN，作为扶正化瘀方直接抗肝纤维化靶蛋白，结果见图3。

图3 扶正化瘀方蛋白互作网络

2.4 GO生物过程富集分析

将药物—疾病筛选出的共有靶点125个输入metascape数据库中，分别进行细胞成分（GO cellular components）、分子功能（GO molecular functions）、生物途径功能（GO biological processes）三方面的GO富集分析，设定阈值相关性＜0.01，最小计数=3，富集因子＞1.5，根据-log10P值筛选出相关性前20途径，其中靶基因细胞成分主要与膜筏（membrane raft）、蛋白质激酶复合物（protein kinase complex）相关，见图4a；靶蛋白分子功能主要与DNA结合转录因子绑定（DNA-binding transcription factor binding）呈显著相关，见图4b；生物途径功能则主要与对脂糖的反应（response to lipopolysaccharide）、炎症反应（inflammatory response）、凋亡信号通路（apoptotic signaling pathway）、对化学应激的细胞反应（cellular response to chemical stress）等多种生物途径功能高度相关，见图4c。

2.5 KEGG信号通路富集分析

据KEGG信号通路分析，选取阈值＜0.01，得出结果显示扶正化瘀方抗肝纤维化是经过多条通路的作用结果方式，与癌症的路径（Pathways in cancer）、糖尿病并发症中的衰老信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、丙型肝炎（Hepatitis C）、TNF信号通路（TNF signaling pathway）、麻疹（Measles）、癌症中的蛋白体（Proteoglycans in cancer）、HIF-1信号通路（HIF-1 signaling pathway）、MAPK信号通路（MAPK signaling pathway）、NF-卡帕B信号通路（NF-kappa B signaling pathway）、疟疾（Malaria）等多种途径高度相关，综合分析具有富集显著相关性排行前十的通路，并绘制通路图，见图5。使用metascape数据库中PPI网络的MCODE功能，结果得出两组蛋白互作用紧密，见图6。其中TNF、MAPK8、JUN等27个靶蛋白为一组重要的靶蛋白簇，经KEGG信号通路分析得出该组靶蛋白簇与TNF信号通路密切相关；另一组重要的靶蛋白簇包含：HIF、STAT1、MAPK14等24个靶蛋白，经KEGG信号通路分析得出该组靶蛋白簇与HIF信号通路密切相关。

图5 KEGG信号通路富集分析图

图6 PPI网络模块分析

3 讨论

肝纤维化是慢性肝病的典型病理特征，是一个动态病理生理过程，可严重影响肝脏功能，符合中医病机、病位动态演变的规律，因此中医药在治疗肝纤维化方面具有独特优势[12]。扶正化瘀方是由上海中医药大学针对肝纤维化血瘀研制，由丹参、冬虫夏草、桃仁、松花粉、绞股蓝、五味子等六味中药组成，诸药合用活血化瘀、益精养肝，从而达到抗肝纤维化的效果[13]。

在获取扶正化瘀方活性成分时发现，扶正化瘀方的主要药效药物包括丹参中的丹酚酸B、桃仁中的苦杏仁苷和冬虫夏草中的虫草素等[1]。苦杏仁苷在抑制肝星状细胞的增值和胶原生成方面作用尤为突出，与虫草菌丝同用时对血吸虫肝病患者的肝纤维化有着明显改善，而单用时在肝纤维化模型大鼠体内观察到肝纤维化的转好趋势。其中丹酚酸B显著改善慢性乙肝肝纤维化患者的肝纤维化，可抗肝细胞过氧化损伤、抑制肝星状细胞活化[1]。

本研究通过文献检索获得扶正化瘀方中丹酚酸B、虫草酸、虫草素、苦杏仁苷、聚-β-羟丁酸、绞股蓝提取物、五味子素7种主要活性成分，并通过筛选和文献检索出扶正化瘀方608个潜在靶点，并构建扶正化瘀方相关作用靶点—肝纤维化发病机制网络，从中发现125个扶正化瘀方抗肝纤维化的主要靶点基因，表明了扶正化瘀方具有多靶点抗肝纤维化作用。

本研究在通过对扶正化瘀方GO分析的过程中发现，靶基因主要与细胞成分、分子功能、生物途径功能三条途径显著相关，接着通过KEGG富集通路分析选取前十位途径，分别为癌症的路径、糖尿病并发症中的衰老信号通路、丙型肝炎、TNF信号通路、麻疹、癌症中的蛋白体、HIF-1信号通路、MAPK信号通路、NF-卡帕B信号通路、疟疾。其中发现HIF-1信号通路和TNF信号通路是治疗肝纤维化的特征通路。在慢性炎症过程中，炎症细胞的积累和纤维化可能导致缺氧，增加了受损组织对血流和氧气供应的阻力。已有证据表明，血管生成，和炎症的发生是由于缺氧的刺激所导致的。缺氧激活血管生成是缺氧诱导因子（HIFs）介导的信号通路的结果[14]。在炎症和缺氧等特殊情况下，HIF表达被诱导结合IRP1和IRP2，从而促进TFRC转录，HIF-1α也可通过结合DNA调控TFRC的转录，随后生成的TFRC蛋白可促进铁代谢，增加供氧[15]。丹参、绞股蓝和冬虫夏草等药物中的MAPK1、EGFR、PKC等药物靶点与HIF-1α基因表达密切相关[16]。已有研究表明丹参素能在5 μmol·L-1～100 μmol·L-1浓度范围内浓度依赖性的下调HIF-1α蛋白表达（＜0.01），进而抑制HIF-1信号通路[16]。TNF-α一方面在慢性肝炎的发病机制中起着关键作用，他强效促进炎症反应的发生[17]，另一方面TNF-α具有消除炎症、抑制肿瘤生长的功能[18]。因此TNF-α因子成为慢性肝炎和肝纤维化的强制性调节因子[19]。已有研究表明，TNF-α可抑制促纤维化因子的表达，如：α-SMA、NF-κB p65、TGF-β1，进而促进基质的降解，从而减少基质生成发挥抗肝纤维化作用[20]。从现有数据结果分析得出扶正化瘀方治疗肝纤维化理论上具有积极的治疗效果，多条通路显示该方抑制肝纤维化向慢性肝炎进一步发展。

4 结束语

综上所述，本研究通过网络药理学方法分析得出了扶正化瘀方治疗肝纤维化的相关作用靶点，其中重要蛋白质靶点共7个，并对其进行富集分析与通路的注释进一步理解药物与疾病相互作用机制提供了重要信息。但本研究仅基于网络药理学上对扶正化瘀方治疗肝纤维化的探讨，并未通过实验进一步验证，由于数据库信息尚未全面等原因存在一定的局限性。因此对扶正化瘀方抗肝纤维化的基础实验验证将成为下一步研究的重要内容。

[1] 赵志敏，刘成海. 扶正化瘀方抗肝纤维化的主要作用机制与效应物质[J]. 上海医药，2016，37(13): 13-16.

[2] Lee W Y, Cheung C C, Liu K W, et al. Cytotoxic effects of tanshinones from Salvia miltiorrhiza on doxorubicin- resistant human liver cancer cells[J]. Journal of Natural Products, 2010, 73(5): 854.

[3] Seki E, Brenner D A. Recent advancement of molecular mechanisms of liver fibrosis[J]. Journal of Hepato-Biliary-Pancreatic Sciences, 2015, 22(7): 512-518.

[4] 原琪，王贞香，刘雨娟，等. 肝纤维化中星状细胞的作用机制及靶向治疗[J]. 医学食疗与健康，2021，19(4): 200-201.

[5] 仰贤莉，李光伟，康璐，等. 扶正化瘀方抗大鼠肝纤维化疗效的代谢组学研究[J]. 中成药，2016，38(11): 2342-2346.

[6] Ru J, Li P, Wang J, et al. TCMSP: A database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines[J]. Journal of Cheminformatics 2014, 6: 13.

[7] Rovatsos M, Altmanová M, Augstenová B, et al. ZZ/ZW sex determination with multiple neo-sex chromosomes is common in madagascan chameleons of the genus furcifer (reptilia: chamaeleonidae)[J]. Genes, 2019; 10(12): 1020.

[8] Szklarczyk D, Gable AL, Lyon D, et al. STRING v11: protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets[J]. Nucleic Acids Research, 2019, 47(D1): D607-D613.

[9] Amberger J S, Hamosh A. Searching Online mendelian inheritance in man (OMIM): A knowledgebase of human genes and genetic phenotypes[J]. Current Protocols in Bioinformatics, 2017, 58: 1-12.

[10] Fishilevich S, Nudel R, Rappaport N, et al. GeneHancer: genome-wide integration of enhancers and target genes in GeneCards[J]. Database, 2017; 2017: 28.

[11] Zhou Y, Zhou B, Pache L, et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets[J]. Nature Communications, 2019, 10(1): 1523.

[12] 霍苗苗，程变巧，林伟国，等. 扶正化瘀方对非酒精性脂肪性肝病大鼠肝纤维化及ACE-Ang Ⅱ-AT1R轴的影响[J]. 解放军医学杂志，2018，43(2): 114-119.

[13] Lee W Y, Cheung C C, Liu K W, et al. Cytotoxic effects of tanshinones from Salvia miltiorrhiza on doxorubicin- resistant human liver cancer cells[J]. Journal of Natural Products, 2010, 73(5): 854.

[14] Elpek G Ö. Angiogenesis and liver fibrosis[J]. World Journal of Hepatology, 2015, 7(3): 377-391.

[15] Xu X, Liu T, Wu J, et al. Transferrin receptor-involved HIF-1 signaling pathway in cervical cancer[J]. Cancer Gene Therapy, 2019, 26(11): 356-365.

[16] Xu H Y, Zhang Y Q, Liu Z M,et al. ETCM: An encyclopaedia of traditional Chinese medicine[J]. Nucleic Acids Research, 2019, 47(D1): D976-D982.

[17] Horiuchi T, Mitoma H, Harashima S, et al. Transmembrane TNF-alpha: structure, function and interaction with anti-TNF agents[J]. Rheumatology, 2010, 49(7): 1215-1228.

[18] Kemanetzoglou E, Andreadou E. CNS demyelination with TNF-α blockers[J]. Current Neurology and Neuroscience Reports, 2017, 17(4): 36.

[19] Park S, Kim J W, Kim JH, et al. Differential roles of angiogenesis in the induction of fibrogenesis and the resolution of fibrosis in liver[J]. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2015, 38(7): 980-985.

[20] 刘雪冰，吴玉潇，刘谢，等. 扶正化瘀胶囊对肝纤维化患者细胞因子的调控作用[J]. 中西医结合肝病杂志，2020，30(4): 367-371.

Study on the Molecular Mechanism of Fuzheng Huayu Prescription Against Liver Fiber Based on Network Pharmacology

Objective: To analyze the molecular mechanism of Fuzheng Huayu prescription against liver fibrosis based on network pharmacology. Methods: Using OMIM, GeneCards and other databases to obtain liver fibrosis related targets, Venn diagram was used to interact the action targets of the active components of Fuzheng Huayu prescription and liver fibrosis related targets; using String database and metascape database to annotate the genes and signal pathways of the interactive targets, and clarify the molecular mechanism of Fuzheng Huayu prescription against liver fibrosis. Results: The anti-liver fibrosis components in Fuzheng Huayu prescription were selected: including amygdalin in peach kernel, salvianolic acid B in salvia miltiorrhiza and cordyceps sinensis in cordyceps mycelium. The main chemical components of salvia miltiorrhiza are water-soluble components (tanshinol, salvianolic acids A and B, rosmarinic acid, protocatechuic acid, protocatechuic aldehyde, etc.) and fat soluble components (dihydrotanshinone I, tanshinone IIA, etc.). Tanshinones are the main fat soluble components of salvia miltiorrhiza, mainly including Tan IIA, cryptotanshinone (CPT), tanshinone Ⅰ, dihydrotanshinone, etc. Tan IIA is tanshinone with the most content and the most in-depth research at present. Tan IIA is a diterpene quinone compound, which has many activities, such as anti-inflammatory, anti-tumor, cardiovascular protection and so on. These active components of Fuzheng Huayu prescription were screened through TCMSP database, and the action targets of the active components of Fuzheng Huayu prescription were obtained. The obtained action target is converted into gene name through UniProt database, and it is imported into String database to obtain action target interaction data, and the interaction network is constructed by using Cyctoscape3.4.0. The target proteins related to liver fibrosis were obtained from OMIM and GeneCards databases, and the compound targets were interacted with liver fibrosis targets to obtain overlapping targets. Conclusion: This study reflects the characteristics of Fuzheng Huayu prescription's multi-target and multi-channel action, and its multiple pathways are related, which provides a good basis for further research.

Fuzheng Huayu prescription; network pharmacology; liver fibrosis; signaling pathways; HIF

R285; R575

A

1008-1151(2022)08-0059-05

2022-05-20

国家自然科学基金项目（81960751、81660705）；广西自然科学基金青年项目（2020GXNSFBA297094）；广西中青年教师科研基础能力提升项目（2020KY1667）；广西壮瑶药重点实验室（GXZYZZ2019-1、GXZYZZ2020-07）；广西中医药大学一流学科（2019XK141）；广西中医药大学青年基金（2020QN006）；广西中医药大学赛恩斯新医药学院2021年大学生创新创业训练计划项目（202113643019）。

王玉婷（2001－），女，福建龙岩人，广西中医药大学赛恩斯新医药学院学生，研究方向为民族药防治慢性肝病。

郑洋（1991－），广西中医药大学赛恩斯新医药学院助教，硕士，研究方向为民族药防治慢性肝病。