王静静，舒 波，2，于晓慧，克军宏，3，邢安琪，4，彭真奇，5，刘华雷

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2.江西农业大学，江西南昌 330045；3.塔里木大学，新疆阿拉尔 843300；4.宁夏大学，宁夏银川 750021；5.安徽农业大学，安徽合肥 230036）

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）强毒株感染引起的，可危害多种禽类的烈性传染病。世界动物卫生组织（WOAH）将ND 列为法定报告动物疫病，我国农业农村部将其列为二类动物疫病。鸡、鸽等易感禽类感染NDV 后，发病率和死亡率可高达100%[1-2]。NDV 基因组全长有15 198、15192 和15 186 nt 3 种长度，共包含6 个基因片段，3'-NP-P-M-F-HN-L-5'，其中F基因和HN基因是主要的毒力决定基因[3]。NDV 可分为Class I 和Class II 两类，其中强毒株均属于Class II[4]。国家新城疫参考实验室监测数据显示，我国目前流行的强毒株主要是Class II 的基因VI 型和VII 型，其中鸽源基因VI 型NDV 近年分离率明显升高[5-6]。

通过接种鸡胚进行病毒分离和RT-PCR 测序鉴定是确诊ND 的“金标准”[7-8]，然而这些方法对生物安全要求高，步骤繁琐，耗费时间长，成本较高，不能做出快速诊断。近年来，随着分子生物学技术的发展，数字PCR（dPCR）被广泛应用于多种动物病原的精准检测[9-11]。dPCR 是先对模板进行预处理，将其稀释分配到许多个独立的单元，每个单元有1 个目标序列的PCR 微反应区，PCR 扩增结束后，通过采集荧光信号进行量化（阳性记作1，阴性记作0），再引入泊松概率分布函数进行计算，从而得到样本的初始拷贝数，对样本进行绝对定量[12-13]。该方法灵敏度极高，可检测到样本中低拷贝数的核酸，且大大节约了检测时间和检测成本，在动物疫病检测中具有广阔的应用前景[14]。本研究利用dPCR 技术平台，针对基因VI 型NDVF基因保守区设计引物和探针，建立了一种快速、有效、灵敏度高的RT-dPCR 检测方法，以期为在鸽群中开展基因VI 型NDV 快速检测和研制诊断用核酸标准物质奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 基因VI 型、VII 型、XII 型NDV，H5、H7、H9 亚型禽流感病毒（AIV），鸡传染性支气管炎病毒（IBV），鸡传染性喉气管炎病毒（AILTV），禽腺病毒（FAdV）等常见禽病病原，均由中国动物卫生与流行病学中心禽病监测室保存。

1.1.2 临床样品 180 份鸽口咽/泄殖腔拭子，由中国动物卫生与流行病学中心2021 年从国内部分地区活禽市场采集。

1.1.3 试剂盒 核酸提取试剂盒（High Pure Viral Nucleic Acid Kit），购自Roche 公司；RT-PCR 试剂盒（Primescript One Step RT-PCR Kit Ver.2），购自TaKaRa 公司；荧光RT-PCR 试剂盒（SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit），购自Invitrogen 公司；一步法反转录数字PCR 反应预混液（RT-dPCR Kit），购自苏州思纳福医疗科技有限公司。

1.1.4 鸡胚 9～11 日龄SPF 鸡胚，购自山东济南斯帕法斯家禽有限公司。

1.2 引物、探针设计与筛选

从GenBank 上下载NDVF基因序列，采用MEGA 6 进行序列比对分析，选取保守区域设计3套特异性引物和探针（表1），并通过荧光RT-PCR和RT-dPCR 方法筛选出最佳引物探针组合。引物和探针由宝生物工程（大连）有限公司合成。

表1 RT-dPCR 引物和探针

1.3 病毒核酸提取

按照核酸提取试剂盒说明书提取病毒核酸，立即用于RT-dPCR 扩增，或置-80 ℃保存备用。

1.4 RT-dPCR 反应

反应体系见表2。反应程序：50 ℃，15 min；95 ℃，3min；95℃ 30 s，58 ℃ 60 s，42 个循环。升降温速率2 ℃/s。

表2 RT-dPCR 反应体系

1.5 灵敏度试验

将基因VI 型NDV 核酸进行10 倍倍比稀释，分别取100、10-1、10-2、10-3、10-4稀释度样品进行RT-dPCR 检测，每个浓度做3 次重复检测，评价方法的灵敏度。

1.6 特异性试验

提取基因VI 型、VII 型、XII 型NDV，H5、H7、H9 亚型AIV，IBV，AILTV，FAdV 病毒核酸，使用RT-dPCR 方法进行检测，验证方法的特异性。

1.7 重复性试验

用建立的RT-dPCR 方法对基因VI 型NDV 核酸进行检测，重复测定6 次，计算标准差和变异系数，评价方法的重复性。

1.8 临床样品检测

用建立的RT-dPCR 方法对临床采集的180 份鸽口咽/泄殖腔拭子样品进行检测，并与病毒分离方法检测结果进行比较。

2 结果

2.1 引物探针筛选

用设计的3 组引物探针组合对基因VI 型NDV核酸进行荧光RT-PCR扩增。结果（表3）显示，第3 组引物探针扩增Ct 值略低于前两组。用设计的3 组引物探针进行RT-dPCR 扩增，结果显示，3组引物探针均可有效扩增，故最终选择第3 组引物探针用于RT-dPCR 方法建立。

表3 3 组引物探针组合荧光RT-PCR 扩增Ct 值

2.2 灵敏度试验

将基因VI 型NDV 核酸进行10 倍倍比稀释（100～10-4）后进行RT-dPCR 检测，每个浓度做3 次重复，获得梯度稀释扩增图（图1）和标准曲线y=1.021x-0.132（图2），R2=0.993。结果说明，本方法具有较高扩增效率，且在1.97×100～1.30×104copies/μL 的检测范围内具有良好的线性关系，最低检测限为1.97 copies/μL。

2.3 特异性试验

用建立的RT-dPCR 方法检测基因VI 型、VII型、XII 型NDV，H5、H7、H9 亚型AIV，IBV，AILTV，FAdV 等9 种病毒核酸，仅有基因VI型NDV 检测结果为阳性，其余病毒检测结果均为阴性（图3）。

2.4 重复性试验

取同1 份基因VI 型NDV 核酸样品，经RTdPCR 重复测定6 次。结果（表4）显示，变异系数为2.2%，表明本方法重复性好，结果稳定、可靠。

表4 重复性试验结果

2.5 临床样品检测

用建立的RT-dPCR 方法对临床采集的180 份鸽口咽/泄殖腔拭子样品进行检测，结果检出阳性样品14 份，同时对180 份样品进行病毒分离鉴定（鸡胚接种、RT-PCR 扩增和测序、序列分析），结果显示14 份阳性样品均为基因VI 型NDV。RT-dPCR检测结果与病毒分离鉴定结果完全一致，符合率为100%，说明本研究建立的RT-dPCR 方法可信度高，可用于临床样品中基因VI型NDV的检测。

3 讨论

基因VI 型NDV 是引发鸽ND 的主要病原，严重危害我国鸽业健康发展。自20 世纪80 年代鸽ND 传入我国以来，一直在我国鸽群中流行和传播[15-16]。ND 与禽流感、传染性支气管炎、传染性喉气管炎等禽类呼吸道疾病在鉴别诊断上难以区分，甚至一些APMV-13 和APMV-7 等副黏病毒也能与NDV 发生HI 交叉反应[15-16]，因此快速鉴定NDV 对于养禽业意义重大[17]。ND 的早期诊断主要通过血清学方法，如血凝抑制试验、病毒中和试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫组化法（IHC）等[18]，这些检测技术虽然能检测NDV 但是不能判断其基因型和病毒毒力，而且有些毒株无法被ELISA 等技术检测到[19]。RT-PCR、荧光RTPCR、环介导等温扩增技术（LAMP）等分子生物学方法是目前应用最广泛的方法[20]。RT-PCR 和荧光RT-PCR 虽然能快速准确检测NDV，但其灵敏度和准确度还有待提高，而且经常会出现假阳性结果，也无法检测到所有NDV[21]。LAMP 需要针对模板设计4 对引物，方法的建立难度较大，LAMP多路复用也增加了该方法的局限性[22]，而且，上述方法均不能对病原进行绝对定量。

随着科技的不断发展，1999 年Bert Vogelstein和Kenneth W.Kinzler 建立了第三代PCR 技术，即dPCR 技术[23]。dPCR 与第一代和第二代PCR 技术相比，具有更高的灵敏度、精确度、耐受性以及绝对定量等优点，弥补了荧光PCR 依靠Ct 值间接定量的缺陷，也解决了荧光PCR 重复性差的问题[24]。dPCR 可用于稀有突变检测[25-26]、拷贝数变异分析[27]、复杂样本基因表达检测[28]等。近年来，在动物疫病检测中的应用越来越广泛，陈亚娜等[29]和谭建锡等[30]分别利用dPCR 技术建立了伪狂犬病毒和H1 亚型猪流感病毒微滴式dPCR 检测方法，提高了检测的灵敏性和准确度。但由于其检测高浓度核酸样品时，无法实现精准定量，目前dPCR 还不能完全取代荧光PCR[31]。

本研究利用dPCR 技术，针对基因VI 型NDVF基因保守区域设计特异性引物和探针，建立了一种可快速、特异、灵敏检测基因VI 型NDV 的RT-dPCR 方法，可用于临床上鸽NDV 的精准检测及样本中病毒核酸的精确定量，为研制诊断用核酸标准物质奠定了基础。