陈 浩，鞠永政，王文文，尹明荣，李 阳，王一新

（1.山东农业工程学院农业科技学院，山东济南 250100；2.山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271018；3.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）是一种有囊膜的冠状病毒，其基因组为单股正链RNA。PEDV 可引起猪的水样腹泻、急性呕吐和脱水。尽管各年龄段猪均可被感染，但仔猪尤其易感，其感染后的发病率及病死率可达100%。PEDV 逐渐呈全世界流行[1]，2010 年，G1b亚型PEDV 变异株在我国大面积流行，给我国养殖业造成严重经济损失[2-5]。猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）、猪δ 冠状病毒（porcine deltacoronavirus，PDCoV）及猪轮状病毒（porcine rotavirus，PoRV）等胃肠道病毒均能引起与PEDV 感染相似的临床症状，因此开发一种可以快速准确检测PEDV 的方法至关重要。

目前，多种实验室诊断技术已应用于PEDV检测，如病毒分离鉴定、酶联免疫吸附试验（ELISA）、胶体金检测试纸条、PCR 技术、核酸等温扩增技术等[6-8]。其中，实时荧光定量PCR 技术因其灵敏度高、操作简便且可以实现病毒核酸定量，已被广泛应用于动物病原检测[9]。本研究以PEDVN基因保守序列为靶位点，设计1 对特异性引物，建立了PEDV SYBR Green I 荧光定量RT-PCR 检测方法，并利用该方法对2018—2019年从山东省4 个地区采集的161 份临床样品进行了检测，以期为PEDV 感染的快速鉴别诊断及防控提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 毒株

PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV、猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV），均由山东农业大学动物检疫研究室分离并保存。

1.2 主要试剂与仪器

PrimeScript™ One Step RT-PCR Kit、One Step TB Green PrimeScript RT-PCR 荧光定量试剂盒，购自宝生物工程（大连）有限公司；病毒RNA 提取试剂盒、凝胶纯化试剂盒、质粒小量提取试剂盒，购自北京诺贝莱生物科技有限公司；高保真DNA聚合酶、pEASY-T3 载体试剂盒、T7 体外转录试剂盒、DNA Marker，购自北京全式金生物技术有限公司；DH5α 感受态细胞，购自天根生化科技（北京）有限公司；荧光定量PCR 仪Light Cycler 96，Roche 公司产品。

1.3 引物设计与合成

使用MegAlign 软件对PEDVN基因保守序列进行分析，运用Primer 5.0 软件设计2 对特异性引物（表1）。其中，P1/P2 用于PEDVN基因部分序列扩增并构建标准质粒，F/R 用于荧光定量PCR扩增。引物送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物序列

1.4 标准质粒构建

提取病毒RNA，以引物对P1/P2 进行RT-PCR扩增，回收纯化扩增产物，将pEASY-T3 载体与扩增片段连接，转化DH5α 感受态细胞。通过菌液PCR 筛选阳性克隆，并将阳性克隆子送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。扩大培养测序正确的克隆子，提取质粒，作为PEDVN基因标准质粒。

1.5 标准品制备

使用EcoR I 限制性内切酶处理PEDVN基因标准质粒，使其线性化。按照T7 启动子体外转录试剂盒说明书配置反应体系，反应体系于37 ℃孵育1 h，加入1 μL DNase，振荡混匀后，37 ℃孵育15 min。将体外转录得到的RNA 通过乙醇沉淀纯化，并使用分光光度计定量，作为标准品。

1.6 反应体系优化

参考一步法SYBR Green I 荧光定量RT-PCR试剂盒说明书，以RNA 标准品为模板配制反应体系（20.0 μL）：RT-PCR Buffer 10.0 μL，RT enzyme Mix II 0.4 μL，ExTaq聚合酶0.4 μL，F/R各0.4 μL，RNA 模板2.0 μL，DEPC 水6.4 μL。将配好的反应体系置于荧光定量PCR仪中进行扩增。使用棋盘法对10、25、50 nmol/mL 3 个引物浓度进行优化，以确定最佳反应体系。

1.7 标准曲线绘制

将RNA 标准品进行10 倍倍比稀释，使其终拷贝浓度依次为106～ 101copies/μL。以倍比稀释的RNA 标准品为模板进行SYBR Green I 荧光定量RT-PCR 扩增，每个稀释度做3 次重复，以获得的数据绘制标准曲线。

1.8 灵敏度、特异性和重复性检测

以倍比稀释的RNA 标准品为模板，同时用本研究建立的SYBR Green I 荧光定量RT-PCR 方法和常规RT-PCR 方法进行扩增，评价方法的灵敏度；提取TGEV、PDCoV、PoRV、CSFV、PRRSV 等病毒RNA，以建立的SYBR Green I 荧光定量RT-PCR 方法进行检测，评价方法的特异性；取3 份PEDV 阳性临床样品进行SYBR Green I 荧光定量RT-PCR 扩增，评价该方法的批内和批间重复性。批内重复：将上述RNA 样品分别设立3 次重复，在同一反应条件下同时检测，计算批内变异系数（标准偏差/重复值平均数）；批间重复：将上述RNA 样品分别进行3 次独立的荧光定量RT-PCR 检测，计算批间变异系数。

1.9 临床样品检测

2018—2019 年，采集山东泰安、滨州、潍坊和临沂4 个地区出现腹泻症状病猪的161 份临床样品，其中64 份为肠道组织，97 份为粪便样品。使用病毒RNA 提取试剂盒抽提肠道组织和粪便样品RNA，运用本试验建立的SYBR Green I 荧光定量RT-PCR 方法和RT-PCR 方法进行平行检测。

2 结果

2.1 标准品制备

提取PEDV RNA，通过常规RT-PCR 扩增病毒N基因部分序列（图1）。回收目的条带，连接至pEASY-T3 载体，构建标准质粒pEASY-N。通过EcoR I 酶切质粒使其线性化，使用T7 体外转录试剂盒制备RNA 标准品。经分光光度计测定，所制备的RNA 标准品质量浓度为235 ng/μL，置于-70 ℃备用。

2.2 反应体系优化

通过棋盘法对引物浓度进行优化，确定最佳引物浓度为10 nmol/mL。最终确定的反应体系：One Step TB Green RT-PCR Buffer 10.0 μL，RT enzyme Mix II 0.4 μL，ExTaq聚合酶 0.4 μL，F/R（10 nmol/mL）各0.4 μL，病毒RNA 2.0 μL，DEPC 水6.4 μL，总体系为20.0 μL。扩增条件为：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40个循环。

2.3 标准曲线建立

以倍比稀释的RNA 标准品为模板进行SYBR Green I 荧光定量RT-PCR 扩增。扩增曲线（图2-A）和标准曲线（图2-B）显示，当RNA 标准品拷贝浓度在106～101copies/μL 时，拷贝数对数值（x轴）与Ct 值（y轴）线性方程为y=-3.112 4x+30.68，R2=0.998，表明该方法具有较好的线性关系。

2.4 灵敏度试验

以梯度稀释的RNA 标准品为模板，同时进行SYBR Green I 荧光定量RT-PCR 和常规RT-PCR 扩增。结果显示，本研究所建立的方法最低检测限为10 copies/μL，而常规RT-PCR 为103copies/μL，表明SYBR Green I 荧光定量RT-PCR 方法的灵敏度是常规RT-PCR 的100 倍。

2.5 特异性试验

分别以PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV、CSFV 和PRRSV 为模板，用本试验建立的SYBR Green I 荧光定量RT-PCR 方法进行检测。结果（图3）显示，该方法仅对PEDV 有特异性扩增，而对上述常见胃肠道病毒均无扩增，表明该方法具有较强的特异性。

2.6 重复性试验

提取3 份临床PEDV 阳性样品RNA，用本试验建立的SYBR Green I 荧光定量RT-PCR 方法进行批内、批间重复性测试。结果（表2）显示，该方法的批内变异系数为0.24%～0.51%，批间变异系数为1.05%～1.52%，表明该方法重复性较好。

2.7 临床样品检测

同时用本研究建立的SYBR Green I 荧光定量RT-PCR 方法和RT-PCR 方法对采集的161 份临床样品进行检测。结果显示，两种方法的检测结果完全一致，符合率为100%，说明本研究建立的方法可信度高，可用于临床样品中PEDV 检测。

3 讨论

猪流行性腹泻（PED）是由PEDV 引起的，以急性水样腹泻、呕吐及脱水为主要特征的常见猪胃肠道传染病。该病对仔猪威胁较大，可导致新生仔猪接近100%的死亡率。2010 年之前，PED 在我国以散发为主，2010 年之后，在我国多个省份暴发，给养猪业造成巨大经济损失。因此，及时对发病猪进行准确的早期诊断，对于PED 的防控和治疗尤为重要。分子生物学方法具有操作简便、反应迅速、结果可靠等优点，但是常规RT-PCR 灵敏度和特异性有限，LAMP 等温扩增技术易出现气溶胶污染，TaqMan 探针法荧光定量PCR 技术存在成本较高等问题，相较而言，SYBR Green I 染料法荧光定量PCR 技术不需要探针，兼具灵敏度和成本优势，更适合在基层推广。

PEDV 基因组为不分节段的单股正链RNA，长约28 kb，编码7 个主要蛋白（ORF1a、ORF1b、S、ORF3、E、M 和N）。其中，N基因编码的病毒核衣壳蛋白在不同PEDV 毒株之间保守程度较高[10]。因此，本试验针对N基因保守序列设计引物，建立了PEDV 检测方法。为制备SYBR Green I 荧光定量RT-PCR 方法标准品，本试验首先构建了PEDVN基因重组质粒，利用其携带的T7 启动子，体外转录获得RNA 模板，作为标准品。本试验选择定量的RNA 作为标准品而非质粒或cDNA[11-12]，是因为这样可以有效避免临床样品检测时，不同待测样品之间反转录效率的差异，从而使结果更加可靠、准确。灵敏性、特异性和重复性试验结果表明：本研究所建立的SYBR Green I 荧光定量RT-PCR方法灵敏度高，最低检测限为10 个RNA 核酸拷贝；特异性强，仅特异性扩增PEDV，对其他常见胃肠道病毒均无非特异扩增；重复性较好，批内及批间Ct 值的变异系数均小于2%。利用该方法和国标推荐的RT-PCR方法对161份临床样本进行平行检测，符合率为100%，说明本方法可信度高，可用于临床样品中PEDV 检测。