焉 鑫，刘蒙达，张 力，李 岩，孙淑芳，樊晓旭

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2.新疆生产建设兵团畜牧兽医工作总站，新疆乌鲁木齐 830000）

近十几年来，H7N9流感、寨卡病毒病、登革热、“非典”等新发、突发传染病暴发逐渐增多，与此同时结核病、布鲁氏菌病等传统重要的人兽共患病也有逐渐抬头的趋势。特别是2019 年底暴发的新冠肺炎疫情，目前已经发展到全球大流行阶段[1]。在全球一体化大背景下，快速识别感知病原微生物，对于动物健康、公共卫生安全、食品安全具有重要意义。

病原微生物检测技术主要包括病原分离培养、免疫学检测和核酸检测。其中，核酸检测技术具有敏感性高、限制因素少、易于操作等优点，目前已得到广泛使用。自20 世纪中叶聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）发明以来，随着分子生物学技术的不断革新，实时荧光定量PCR 技术（real-time fluorescent quantitative PCR，RT-qPCR）[2]、环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）[3]、重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification，RPA）[4]和重组酶介导扩增技术（recombinase-aided isothermal Amplification，RAA）[5]等基于微生物核酸特异性扩增的检测技术发展迅速。2015 年，Liu等[6]以PCR 和LAMP 检测技术为基础，建立了聚合酶螺旋反应（polymerase spiral reaction，PSR）检测方法。该方法不仅保留了传统PCR 引物设计简单的优势，还具有全部反应只需一种酶，无需反复加样，在恒温条件下即可完成反应，不易出现污染的特点，具有良好的特异性、敏感性和易操作性。本文拟从PSR 技术的原理以及在病原微生物快速检测中的应用方面作综述。

1 原理

1.1 扩增原理

F 段和R 段特异性引物序列结合靶基因上的Fc 和Rc 段，在BstDNA 聚合酶作用下向3'端延伸，形成DNA 双链结构。该双链在甜菜碱的作用下，再次解链为游离的DNA 单链。此时单链上的Nc段与N 段是反向互补的，根据碱基互补配对原则，Nc 段会旋转并与N 段结合形成勾型结构，形成的3'端缺口会被BstDNA 聚合酶用碱基填补，继续向3'端延伸。之后反复重复引物结合、延伸、解链、单链旋转、延伸的循环，最终形成一系列相对分子质量大小不一的复杂结构，达到等温条件下核酸扩增的目的[6]。常规PSR 反应最佳温度一般为65 ℃，在只采用两条主引物的前提下，大约在60 min 内完成扩增。若在体系内引入加速引物IF 和IB，则在30 min 内即可完成扩增反应。若引入逆转录酶建立RT-PSR 方法，也适用于RNA 的快速检测[7]。

1.2 引物设计

基于BstDNA 聚合酶的核酸等温扩增方法的引物设计思路：使扩增引物包括两段先后与靶序列结合且能在扩增中折叠成环的序列，利用酶的置换活性与聚合酶活性，反复延伸、折叠、解离，最终使核酸得到扩增。单一的上下游PCR 引物无法在BstDNA 聚合酶及其反应体系下恒温扩增核酸序列，而PSR 仅需要在PCR 引物的基础上，从靶序列上取一段序列N，将这段序列添加到PCR 引物（F和R）的5'端，构成两条复合引物Ft 和Bt。引物组成及其在靶序列上的结合位点如图1-A 所示。这两条引物就是PSR 反应的主引物。若要进一步提高检测速度及灵敏性，可以分别在F 与N 以及B 与N 之间，从5'端到3'端的方向分别与Ft、Bt相反设计加速引物IF 和IB。IF 和IB 在靶序列上的位置示意图如图1-B 所示。由于都是基于酶的链置换活性原理，PSR 引物设计可参考LAMP 引物设计规则。具体的设计参数如表1 所示，按表1 中的参数进行引物设计，将提高PSR 扩增反应的成功率。

表1 PSR 引物最佳设计参数[8]

1.3 扩增产物判读方式

PSR 扩增产物的判读方式有以下3 种：一是采用实时浊度仪进行浊度的实时监测。该方法可精确得到Ct 值的出峰时间。二是通过琼脂糖凝胶电泳进行结果判定。三是采用指示剂显色法，即将颜色指示剂加入到PSR 反应体系中，通过阴阳性反应的颜色差异，肉眼快速判断试验结果。目前常用的颜色指示剂有SYBR Green I 指示剂[6-7]、钙黄绿素（Calcein）指示剂、羟基萘酚蓝指示剂和pH 颜色指示剂[8-9]。实时浊度仪判断法和琼脂糖凝胶电泳判定法均需要专业的仪器及相对复杂的操作，用于实验室研究尚可，不适用现场快速检测；而指示剂显色法结果判读简单，不需要复杂的仪器及操作，适合现场快速检测。

2 应用

2.1 病毒检测

2.1.1 人兽共患病病毒 Sun 等[10]开发了5'UTR-PSR 方法检测丙型肝炎病毒（HCV）。该方法有良好的特异性和敏感性，可识别所有基因型的HCV，而不与其他病毒发生非特异性反应，检出限可达25 copies/mL，与RT-qPCR 相当，比RTLAMP 高2 倍，且缩短了检测时间。Sharma 等[7]将简化的磁珠RNA 提取法与RT-PSR 相结合，开发了基孔肯雅病毒（CHIKV）的早期筛查方法。该方法的检测限为10 个RNA 拷贝，与RT-qPCR相当，并且检测特异性良好。Tomar 等[11]建立了西尼罗病毒（WNV）的RT-PSR 检测方法，其灵敏性为1 个RNA 拷贝，比普通RT-PCR 灵敏性提升100 倍，与黄病毒、甲病毒和麻疹病毒无交叉反应；对107 份临床样本检测发现，RT-PSR 与RTqPCR 一致性为100%。He 等[12]针对柯萨基病毒A16（CVA-16）VP1编码区保守序列设计特异性引物，建立了CVA-16VP1RT-PSR 检测方法，其模板RNA可在恒温条件下40 min内完成逆转录扩增，检出限为2.4×（101～102）copies/mL，且具有良好的特异性。

2.1.2 动物疫病病毒 Woźniakowski 等[13]基于黑寡妇α-latrotoxin（位置：180～199）（GenBank登录号：KF751511.1）、格鲁吉亚ASFV 2007/1核衣壳蛋白p72（位置：104 980～104 999 和105 116～105 135）和交联引物AB 建立了聚合酶交联螺旋反应（PCLSR）检测方法。该方法在65 ℃45 min 内即可完成扩增，检测P72基因片段的灵敏性为7.2×102copies/μL，且与猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）均无交叉反应，为现场检测非洲猪瘟病毒（ASFV）提供了方法和支撑。Ji 等[14]建立了猪圆环病毒3 型（PCV3）ORF2-PSR 检测方法。该方法的最优反应温度和时间是62 ℃ 50 min，检测灵敏度与LAMP 相当，达1.13×102copies/μL，且与猪伪狂犬病病毒（PRV）、PRRSV、猪圆环病毒2 型（PCV2）、CSFV 和PEDV 均无交叉反应；从临床样本的检测结果看，ORF2-PSR 与LAMP检测方法的符合率接近100%。Wang 等[15]建立的ORF3-PSR 方法能够在62 ℃ 50 min 检测到PEDV核酸的扩增，且灵敏性比普通RT-PCR 高10 倍。Gupta 等[16]建立了犬细小病毒2 型（CPV2）VP2-PSR 检测方法，最优反应温度和时间是64 ℃75 min，最低检出限是5×10-6ng DNA，灵敏度比普通PCR 高10 倍，与RT-qPCR 和LAMP 等方法相当。此外，针对牛疱疹病毒I 型（BHV1）设计特异性引物建立的PSR 方法，经证实也具有良好的特异性和敏感性[17]。

2.2 细菌检测

2.2.1 人兽共患病病原菌 在建立的多种人兽共患病病原菌及食源性病原菌PSR 检测方法中，针对流产型布鲁氏菌，Ashmi 等[18]建立了BruAb2_0168-PSR 方法。该方法特异性好，65 ℃水浴60 min 可最低检测到1.33 fg DNA，灵敏度比普通PCR 高10 000 倍，与RT-qPCR 相当。此外，针对布鲁氏菌疫苗株S19，IS711-PSR 检测方法在保证特异性的前提下，灵敏度较普通PCR 提高了100 倍[19]。Liu 等[20]建立了结核分枝杆菌PSR 检测方法，并据此开发了新型现场核酸快速检测试剂盒。该试剂盒稳定性好、特异性强，DNA 最低检出限是0.92 pg/μL，从临床样品检测结果看，与RT-qPCR 的符合率为91.6%。

2.2.2 食源性病原微生物 近年来，食源性病原微生物感染越来越受到重视。Xu 等[21]收集了涉及猪肉、牛肉、羊肉、鱼肉、鸡肉以及蔬菜等的532份食品样本，针对食品沙门氏菌污染问题建立了invAPSR 检测方法。该方法最低检出限是50 CFU/mL，灵敏度与LAMP 和RT-qPCR 一致。He 等[22]建立了检测副溶血弧菌的tlh-PSR 方法。该方法的核酸最低检出限是300 fg/μL，纯培养最低检出限是2.4 CFU/mL，在65 ℃ 40 min 内即可完成反应，灵敏度较普通PCR 提高了100 倍。此外，肺炎克雷伯杆菌和铜绿假单胞菌等院内感染细菌同样可以应用PSR 方法进行检测[23]。

2.3 其他病原

除了应用于病毒和细菌检测，PSR 也应用于真菌及衣原体诊断检测领域。白色念珠菌是最重要的人类机会性致病菌，当机体免疫功能下降或菌群失调时，白色念珠菌会大量繁殖，引起黏膜皮肤念珠菌病或侵袭性念珠菌病等疾病。Jiang 等[24]建立了白色念珠菌ITS2-PSR 检测方法。该方法的核酸最低检出限是6.9 pg/μL，灵敏度比普通PCR 高10倍。滑液囊衣原体能够引起鸡群的滑液囊衣原体病，导致感染鸡群出现关节肿胀、跛足，蛋鸡出现蛋壳异型、产蛋量下降等症状。Wu 等[25]建立的vlh-PSR 方法在62 ℃和40 min 内可检测到滑液囊衣原体核酸的扩增，特异性良好，且灵敏度较普通PCR 提高了100 倍。

3 总结和展望

在全球一体化，同一个世界，同一个健康的大背景下，新冠肺炎、埃博拉、结核病、布鲁氏菌病等新发病和人兽共患病防控越来越受到国际社会和世界各国的重视。尽早发现感染个体，是在源头控制疫病传播流行的关键，也是降低疫情防控成本的最适手段。因此，针对病原微生物非常有必要开发新型的快速便携式检测方法。PSR 是一种基于LAMP 和PCR 发展起来的新型病原微生物核酸检测技术，其一方面解决了LAMP 引物设计复杂的问题，另一方面较PCR 检测灵敏度高。特别是，相比于PCR、RT-qPCR，PSR 在保留高度特异性、敏感性的基础上，不需要精密复杂的变温仪器，并且加入显色染料后，可以用肉眼直观判定结果，这符合世界卫生组织（WHO）对疾病快速诊断的要求，对提升基层传染病快速检查、筛查能力有重要的应用价值。另外，PSR 的反应温度为65 ℃，避免了RPA/RAA 技术在常温下扩增可能造成的核酸污染假阳性问题。PSR 自2015 年建立以来发展迅猛，但还有很多重要病原体，例如新冠病毒、幽门螺旋杆菌、弓形虫等的PSR 方法未见报道。随着PSR技术的不断发展和完善，该技术以及衍生技术将在病原微生物检测方面具有更广阔的应用前景。