黎芳婷， 李 蜜， 徐淑芬， 王慧敏， 刘永宏， 高程海

( 广西中医药大学 海洋药物研究院/药学院， 南宁 530200 )

红树林生境同时兼备海陆特质，具有高湿度、高盐、缺氧、强辐射及潮汐等环境特征。为了获得生存必需的营养，红树林生境中的微生物被迫与红树植物共生，导致微生物易产生遗传变异从而使其物种多样性丰富，代谢产物活性独特。真红树植物作为红树林生境中的优势种(姜舒等，2020)，是挖掘新菌种和活性菌株的理想载体。广西红树林资源丰富，其面积为全国红树林面积的三分之一，其中真红树植物有12种(廖宝文和张乔民，2014)，是巨大的微生物资源宝库。长期以来关于广西海域微生物活性物质的研究主要集中在红树林生境的放线菌，关于红树植物内生细菌的报道相对较少。姜明国课题组(吴家法等，2017；石松标等，2018；王聪等，2019)和黄大林课题组(黄大林，2013；陈建宏等，2018；郑红芸等，2019)主要致力于对广西红树林生境中放线菌多样性及其生物活性研究。Jiang等(2018)从广西北仑河口多种真红树植物中分离到101株内生放线菌中，一株被鉴定为新种，35株具有显著的抑菌活性。近年来研究发现，红树植物及其根际淤泥中可培养细菌也可产生抑菌、抗肿瘤(Gong et al., 2018)和延缓衰老等生物活性的代谢产物。李菲等(2016)从茅尾海无瓣海桑中分离得到38株内生细菌，其中5株为潜在新物种，5株具有较强的细胞毒活性。李家怡等(2017)从广西山口分离得到17株红海榄内生细菌，发现3株潜在新菌，2株对副溶血弧菌具有较强抑菌活性。李蜜等(2020)从徐闻分离到33株真红树植物内生细菌，其中10株为潜在新种或新属，2株有显著杀线虫活性。李蜜等(2020)从海南西海岸的14份真红树样品中分离到内生细菌38株，3株对秀丽隐杆线虫有显著延缓衰老活性。由此可见，真红树植物可培养细菌物种多样性丰富，代谢产物活性独特，值得我们深入挖掘。研究广西沿海真红树可培养细菌多样性，挖掘新型活性菌株，对完善该海域微生物多样性及新型活性化合物开发具有重要意义。

由于抗生素的滥用，导致多种超级细菌产生，出现越来越多的难治性感染。细菌耐药性已经成为一场国际性的公共卫生危机，是亟须解决的全球性问题(刘丹华等，2019)，研发新型抗耐药菌抗生素迫在眉睫。细菌是产生抗生素及生物活性物质重要微生物资源。蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶是高效的生物活性酶，影响生物体的生理活动，在食品、医药和化工等生物技术方面有巨大的应用价值(马军等，2016)。红树植物共生细菌多样性丰富，能产生多种酶活性类物质和抗生素类化合物(Ntabo et al., 2018)，是潜在酶活性物质及新型抗生素的重要来源。因此，本实验设计合适的分离培养基，以期从广西三种真红树植物及其根际淤泥中分离获得更多未培养细菌，并分析其可培养细菌多样性。通过筛选可培养细菌的抑菌和酶活性，为新型抗生素和酶活性物质提供菌株资源，并为后续广西真红树植物资源开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集 为了探究不同地点及植物部位对真红树植物可培养细菌的影响，课题组于2019 年 12月21日在广西沿海区域采集三种真红树植物的根、茎、叶、花、果实和泥土，按照不同地点分成22份样品。具体信息见表1，根部位样品4份，茎部分6份，叶部分6份，花部分1份，果实2份，泥土3份。经北仑河口红树林自然保护区吴志鹤鉴定，3种真红树分别为秋茄()、木榄()和红海榄()。

表 1 样品采样信息Table 1 Information of collected samples

1.1.2 试剂 16S rRNA基因扩增引物对27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′) 购于全式金生物技术有限公司(中国，北京)；Chelex-100 树脂，2×Easy Taq Supermix BioRad 购于BioRad公司(美国)；5%的次氯酸钠溶液购于朗索医用消毒剂有限公司(中国，杭州)；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 培养基 分离培养基：参考李蜜等(2020)方法配制培养基P3、P7、AGG、M5、M7、M9、M10、M11。发酵培养基：改良 ISP2 液体培养基。酶活性筛选培养基：参考赵雅慧等(2018)方法制作。纤维素酶筛选培养基：LB培养基中加入1%的羧甲基纤维素钠和1.5%的琼脂。淀粉酶筛选培养基：LB培养基中加入1%淀粉和1.5%琼脂。蛋白酶筛选培养基：脱脂奶粉1%，葡萄糖1%，琼脂1.5%。

1.1.4 指示菌 无乳链球菌()NCTC 8181、海豚链球菌()CAIM 527、沙门氏菌()。以上指示菌均由华南农业大学张晓勇课题组提供。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的处理 参考李蜜等(2020)的方法，真红树植物样品用5%次氯酸钠溶液浸泡8 min，无菌水冲洗干净， 75%乙醇中浸泡5 min，无菌水冲洗至无乙醇味。取以上样品约2 g于无菌研钵中，加入2 mL无菌海水研匀即得原液。参考李菲等(2018)的方法，泥土样品除去杂质，取约2.0 g于装有20 mL无菌水(内有玻璃珠)的锥形瓶中，放入摇床摇匀，充分均质即得原液。所有样品原液置于4 ℃冰箱保存。选取M7、P7、M11、M10、M5、AGG、P3、M9 8种分离培养基，取样品的10悬液100 μL涂布(李蜜等，2020)。

1.2.2 可培养细菌的分离纯化、鉴定、保藏 参考吴家法等(2017)的方法，将分离培养平板置于28 ℃恒温培养箱培养2～8周。长出细菌后，挑取质地光滑的单菌落，三线法在ISP2纯化培养基分离纯化，直至获得纯净菌株，记录菌株数量及其形态特征。参考 Chelex-100 法(周双清等，2010)提取已纯化细菌的基因组 DNA，参照Walsh等(1991)的方法对细菌基因组DNA进行PCR梯度扩增。1%琼脂糖凝胶电泳检测阳性扩增产物委托上海美吉生物医药技术有限公司广州分公司进行测序。经DNA Star 软件整理16S rRNA基因测序结果，用数据库EzBioCloud(http://www.eztaxon.org/)(2009)及 Blast 网站进行相似性比对。纯化的菌株保藏于 20%(V/V)甘油管中，置于-80 ℃超低温冰箱中保存。

1.2.3 细菌发酵粗提物的活性筛选

1.2.3.1 细菌发酵及粗提物提取 参考李蜜等(2020)的方法发酵可培养细菌，离心收集的发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取，减压蒸干乙酸乙酯层，用甲醇溶解收集，挥干甲醇即得细菌发酵粗提物，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.3.2 细菌抑菌实验 检定板的制备：参考许敏等(2016)的方法，将生长良好的指示菌接种于装有50 mL已灭菌LB液体培养基的三角瓶中，180 r·min摇床培养9 h得到对数生长期的指示菌混悬液，取混悬液加入灭菌后低于55 ℃的LB(A)培养基中，稀释成0.3%的浓度。灭菌的LB固体培养基倾注到培养皿中，凝固后，再倾注一层加有指示菌的培养基，待其凝固即得检定板。

纸片扩散法进行抑菌活性检测：参考曾臻和谭强来(2019)的方法，用甲醇溶解配成20 mg·mL的细菌发酵粗提物，吸取5 μL至直径为6 mm的无菌滤纸片上(加入5 μL甲醇的滤纸片作阴性对照)，挥干甲醇，贴于检定板表面，于37 ℃培养24 h，观察并记录抑菌圈的大小，实验重复3次，计算抑菌圈平均值。

1.2.3.3 细菌酶活性实验 酶活性菌株的筛选：参考杨桂柳等(2015)的方法，点植法将对数生长期的细菌接种于相应的酶活性平板培养基上，28 ℃恒温培养4～6 d，观察细菌生长情况和菌落周围是否出现透明圈，实验重复3次。

2 结果与分析

2.1 三种真红树植物可培养细菌多样性分析

经菌落形态排重和16S rRNA基因测序比对分析，共获得35株可培养细菌。35株菌株分布在23个科28个属，35株可培养细菌物种组成如表2所示。其中，芽孢杆菌属()占菌株总数14.3%，属于优势菌属，此结果与其他学者研究相同(韩敏敏等，2020)，这表明芽孢杆菌属占红树植物微生物统治地位。Kim等(2014)认为16S rRNA基因序列相似性小于98.65%的菌株有80%为潜在新物种。对三种真红树植物可培养细菌进行新颖性分析，发现35株细菌中有 11株细菌的16S rRNA基因序列相似性低于98.65%，分别为GXIMD 7462、GXIMD 7066、GXIMD 7477、GXIMD 7064、GXIMD 7063、GXIMD 7115、GXIMD 7761、GXIMD 7498、GXIMD 7121、GXIMD 7463、GXIMD 7518，可能为潜在新物种，图1为潜在新菌与相似度最高对照菌的N-J系统进化树。11个潜在新物种隶属于9科11属，其中GXIMD 7477 和GXIMD 7761分别与纤维单胞菌属的巴基斯坦纤维单胞菌()和属的相似度最高，可能为稀有放线菌。说明真红树植物可培养细菌多样性丰富，可为研究生物活性物质提供良好的菌株资源。

图 1 潜在新菌的16S rRNA基因序列N-J系统发育树Fig. 1 N-J phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequences of potential new bacteria

表 2 35株可培养细菌的物种组成Table 2 Species composition of 35 strains of culturable bacteria

2.2 35株细菌在不同真红树植物、植物部位及培养基中的分布

不同植物种类及不同植物生境影响其可培养细菌的丰富程度。如图2所示，从不同样品中分离得到细菌多样性依次是木榄3>红海榄>秋茄2>秋茄1>木榄2>木榄1。3株木榄均采集于防城港，但分离到的菌株种类及数量不同，可能由于植物采集时的老嫩程度及所取的植物组织部位差异所致。两株秋茄分别采样于北海海域两个采样点，采集地点不一致，分离到的细菌种属数量和物种完全不同。秋茄1(F1)分离得到的8株细菌为喜盐噬冷菌()、、特基拉芽孢杆菌()、越南芽孢杆菌()、海水纪氏菌()、sp.、植物内微球菌()、杀珊瑚橙色单胞菌()，秋茄2(F2)分离获得的细菌为拉氏无色杆菌()、、暹罗芽孢杆菌()、枯草芽孢杆菌()、、、、、，两株秋茄植物共有细菌属为芽孢杆菌属，其余均为各自的特有属。由此可见，真红树植物生长不同阶段及植物生境差异可显著影响其可培养细菌物种多样性。

图 2 不同植物分离得到的可培养细菌分布情况Fig. 2 Distribution of culturable bacteria isolated from different plants

不同部位的细菌多样性不同。由图3可知：从6份植物组织茎中分离获得11株可培养细菌，隶属于9个属；4份植物组织根中分离得到的10株细菌隶属于9个属；3份泥土样品分离得到的10株细菌隶属于7个属；6份植物组织叶中分离得到的8株细菌隶属于8个属；1份植物组织花中分离得到的2株细菌隶属于2个属；2份果实中分离得到1株细菌。本研究从植物组织茎中分离得到的细菌数量及多样性均最多，从果实中分离得到的细菌最少。

图 3 不同部位分离得到的可培养细菌分布情况Fig. 3 Distribution of culturable bacteria isolated from different parts

不同培养基分离得到的细菌多样性依次是M10 > M11 = P3 > AGG > M9 > P7 >M5 > M7 (图4)。由此可见，M10(棉籽糖-L-组氨酸培养基)和M11(葡萄糖-酸水解酪素培养基)培养基分离获得的细菌数量和物种多样性均有较明显的优势，可能是L-组氨酸和酸水解酪素等物质能满足细菌生长的营养需求。此结果与其他学者的研究有所区别，李蜜等(2020)从海南西海岸红树林伴生植物分离到的放线菌中，M7培养基得到的放线菌数量最多，而M11培养基分离到的放线菌最少。可能由于放线菌和细菌生长所需的必要营养成分不同，今后可选用M7、M10和M11培养基作为分离培养红树可培养细菌的主要参考培养基。

图 4 不同培养基分离得到的可培养细菌分布情况Fig. 4 Distribution of culturable bacteria isolated from different media

表 3 4株有抑菌活性细菌的抑菌检测结果Table 3 Results of antibacterial test of four antibacterial active bacteria

2.3 三种真红树植物可培养细菌粗提物生物活性分析

2.3.1 可培养细菌的抑菌活性分析 无乳链球菌和海豚链球菌是人畜共患的致病菌，可给水产养殖业造成巨大损失，感染人体可导致脑膜炎等疾病，病死率较高。由于抗生素的滥用，无乳链球菌对青霉素、磺胺二甲基嘧啶和链霉素等普遍耐药，这一问题亟须解决。用滤纸片扩散法对细菌发酵粗提物，进行抑菌活性筛选，共筛选获得4株可培养细菌的发酵粗提物，其中至少对一种指示菌有抑制活性，阳性率为11.4%。如表3所示，菌株GXIMD 7747、GXIMD 7027和GXIMD 7518同时对无乳链球菌和海豚链球菌有抑制作用，GXIMD 7498同时对沙门氏菌和海豚链球菌有抑制作用。活性菌株GXIMD 7498与菌株最高相似度分别为97.91%，来源于木榄3(F5)的茎；GXIMD 7518与菌株鞘氨醇单胞菌() 最高相似度为98.31%，来源于木榄2(F4)的叶子。这两株活性菌株可能为潜在新物种，说明新型菌株在挖掘新化合物领域具有重要的开发价值。

2.3.2 可培养细菌的酶活性分析 蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶是生物活性物质，与人类生活密切相关，在医药食品及化工业等领域具有巨大的市场潜力。通过选育酶活性的细菌，可大规模发酵制备蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶活性物质。真红树植物可培养细菌酶活性结果如表4所示，共获得16株至少有一种酶活性的可培养细菌，阳性率为45.7%，芽孢杆菌属对酶活性比较敏感。菌株暹罗芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、特基拉芽孢杆菌和微杆菌()同时具有淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶活性，占酶活性总菌株数的25%。16株酶活性菌株中，2株同时具有蛋白酶和淀粉酶活性，占酶活性菌株的12.5%(图5)。1株同时具有淀粉酶和纤维素酶活性，占酶活性菌株的6.25%；有2种以上酶活性的菌株有7株，占酶活性菌株的43.75%；具有纤维素酶活性的菌株最多，有13株，占酶活性菌株的81.25%；具有蛋白酶和淀粉酶活性的菌株均为7株，占酶活性菌株43.75%。以上结果表明真红树植物可培养细菌具有显著的酶活性，以纤维素酶活性尤为突出。后续通过优化发酵条件，可以生产酶活性物质应用于医药、食品及化工领域。

表 4 红树植物可培养细菌酶活性结果Table 4 Results of enzyme activities of culturable bacteria in mangrove plants

图 5 酶活性结果分析维恩图Fig. 5 Venn diagram of enzyme activity result analysis

3 讨论与结论

随着陆地资源的不断开发，普通环境下筛选具有独特活性的新菌种越来越困难。因此，红树林特殊生境中的微生物资源逐渐引起研究者的关注。本研究利用8 种不同营养成分的分离培养基对22份真红树植物组织及根际淤泥可培养细菌进行分离纯化， 尽可能丰富未培养和难培养红树微生物资源，共获得35株菌株，分布在23个科28个属。两株秋茄分别采样于北海海域两个采样点，分离到的细菌种属数量和物种完全不同。原因是红树林特殊的环境迫使细菌与红树植物共生，地点不同，红树林生境会有所差别，因此不同地点的同一种红树植物可培养细菌具有地点特异性。本研究中从植物组织茎中分离得到的细菌数量及多样性均最多，从果实中分离得到的细菌最少，此结果与魏玉珍等(2010)、李家怡等(2017)及李蜜等(2020)研究结果有所差别，可能是由于样品采集地点和季节影响不同植物组织细菌的多样性(解修超，2007)，也可能与选取的植物组织数量差异及样品处理方式有关。针对广西沿海同一种真红树植物组织对其可培养细菌的分布及生物学特征是否有特异性影响，还需进一步探索。就物种新颖性分析，分离获得11株细菌16S rRNA基因序列相似性低于98.65%的潜在新菌种，分布于秋茄的根和茎、木榄的叶以及红海榄的根部位，分别在M7、P7、M11、M10、M5、AGG、P3、M9培养基上培养出来，其中有5株从寡营养的燕麦粉琼脂培养基P3上培养获得，说明红树林特殊生境中，共生较多寡营养细菌，P3培养基可以作为发现真红树植物潜在新菌的主要参考培养基。后续对潜在新菌进行多项分类鉴定，可为挖掘新的活性化合物提供菌源。

菌株GXIMD 7477、GXIMD 7027和GXIMD 7518发酵粗提物同时对无乳链球菌和海豚链球菌有抑制作用，GXIMD 7518同时具有抑菌和酶活性，这说明细菌的代谢产物中可能同时存在具有多种活性化合物，也可能是一种化合物有多种活性，后续可以进一步探究。活性菌株GXIMD 7498与菌株最高相似度为97.91%，从木榄3(F5)茎组织的M9培养基中分离得到，抑菌活性菌株GXIMD 7518与菌株鞘氨醇单胞菌()最高相似度为98.31%，从木榄2(F4)叶组织的M5培养基中分离到，这两株活性菌株可能为潜在新物种。说明针对细菌生长所必需养分，通过设计多种不同成分的培养基分离纯化不同样品的可培养细菌，更容易分离得到未培养的潜在活性新菌种。前人研究发现，酶活性菌株GXIMD 7132暹罗芽孢杆菌能产生促进植物生长的吲哚乙酸(Suliasih & Widawati, 2020)，可用作消毒剂，对抗浮游细菌和生物膜驻留细菌(Awan et al., 2020)。由此可见，本研究分离得到的活性菌株有开发成药物和生物技术产品的潜力。广西真红树植物可培养细菌的物种多样性丰富，后续通过优化活性菌株发酵条件，运用化学分离方法，分离粗提物中类抗生素和酶活性物质，可为研究新型抗生素及开发水产养殖药物提供新的药效基础物质，在食品、医药以及化工业等方面有一定开发潜能。