刘丽莎， 贾巧静， 王建星， 张艳茹， 马利娜， 张海中

(1.河北省石家庄市第六医院耳鼻咽喉头颈外科， 河北 石家庄 050000 2.河北医科大学第二医院耳鼻咽喉头颈外科， 河北 石家庄 050000)

头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)好发于40岁以上男性，原发灶多位置隐蔽、早期症状不明显[1]，其发现时多为中晚期。尽管放疗、化疗、免疫治疗及其联合治疗等治疗方法取得了进展，但HNSCC的预后不容乐观，生存时间并没有得到很大的改善[2]。因此，探索HNSCC预后的潜在机制，寻找导致肿瘤进展和不良预后的相关生物标志物是当务之急。母体细胞外囊泡-外泌体(Exosomes，Exos)的双层质膜结构可有效保护内部核酸、蛋白质等生物信息分子不被外界降解，也是细胞将遗传信号传递给周围细胞的重要方式。而Exos能实现细胞间信息传递，已成为多种疾病的新的潜在诊断分子[3]。遗传信息分子miRNAs在HNSCC诊断、预后中更具有代表性、准确性[4]。miRNAs中的miR-96-5p为新型致癌因子，可通过靶向上调TP53突变基因，促进HNSCC细胞侵袭、迁移、增殖等恶性生物学产生，而成为诊断HNSCC的潜在特异性分子[5]。有研究指出HNSCC患者血清miR-96-5p表达水平较高且与HNSCC患者不良预后有关[6]，但Exos中miR-96-5p在HNSCC生物学行为过程中起到的作用尚无研究。叉头框转录因子O亚族(Forkhead box transcription factor O subfamily，FoxO)是重要的癌症抑制因子[7]。本研究采用基因预测软件，其中FoxO1与miR-96-5p之间有结合位点，这预示Exos中miR-96-5p参与调控HNSCC生物学行为作用，很可能与靶向调控miR-96-5p有关。本研究建立动物及细胞模型对此进行验证，以期探究Exos参与HNSCC发生、增殖、侵袭和转移的分子机制，也为HNSCC靶向治疗药物的研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1材料裸鼠，清洁级，36只，购自广东至远生物医药科技有限公司，生产批号：吉林大学(实验动物中心)，批号：SYXK(吉)2021-0006，试验符合3R原则，经本院动物伦理委员会批准同意：IACUC-01(2021210361)。PKH67试剂盒(货号：LM-441112-1，上海联迈生物工程有限公司)；HNSCC细胞系-AGZY-973(货号：CE18963，北京科瑞思搏生物科技有限公司)；miR-96-5p抑制物(miR-96-5p inhibitor)及其阴性对照(inhibitor-NC)、FoxO1过表达质粒(pcDNA-FoxO1)；CCK-8试剂盒均由上海生工公司设计提供；FoxO1、促凋亡蛋白Bax、死亡调解子(Bim)、凋亡蛋白p21均购自美国abcam公司。

1.2方 法

1.2.1HNSCC患者及健康人群血清标本纳入、采集:选取2020年9月至2022年1月在我院耳鼻咽喉头颈外科进行手术治疗的原发HNSCC患者25例作为HNSCC患者组，其中男性15例，女性10例，年龄30～50岁，中位年龄40岁；TNM分期显示肿瘤分期Ⅰ期1例，Ⅱ期4例，Ⅲ期3例，Ⅳ期17例；纳入标准：①病理类型为鳞癌；②不伴有除头部、颈部以外的其他部位恶性肿瘤；③近三个月内未接受放化疗治疗。同期选取体检健康者40例，作为健康对照组，两组受试者年龄、性别等一般资料差异无统计学意义。本实验严格遵照赫尔辛基宣言及“涉及人的生物医学研究伦理审查办法(试行)”，经医院医学科研伦理委员会讨论后批准，所有纳入实验对象均签署知情同意书。受试者均抽取外周静脉血5mL，室温静置30min后，于4℃、1000×g条件下离心10min取上层血清1mL置于1.5mL EP管中，并在-80℃冰箱保存备用。

1.2.2血清Exos制备、分离、鉴定:参考文献中的方法[8]，取1mL受试者血清，加入9mL磷酸缓冲溶液(PBS)稀释、混匀后在4℃、2000×g条件下离心30min，取上清液，在4℃、12000×g条件下离心45min，取上清液，在4℃、110000×g条件下离心120min，弃去上清液，取沉淀物加入9mL的PBS重悬，用0.22μm滤器过滤后，取滤液在4℃、110000×g条件下离心70min，弃去上清液，得到的沉淀物加入500μL PBS重悬后即为Exos悬液。取20μL Exos悬液，加入等体积PBS稀释后，滴加到100目载样铜网上，37℃静置1min，晾干后，用20μL的3%磷钨酸钠溶液滴到铜网上染色1min后，滤纸轻轻吸去多余液体，将铜网在透射电镜下观察拍照，以鉴定Exos形态。分别从健康对照者组和HNSCC患者Exos悬浊液样本中随机分选用于外泌体浓度直径检测(NTA)，观察外泌体样本总体特征差异。取20μL Exos悬液，加入10μL蛋白裂解液裂解30min，13423r/min、4℃离心15min，收集上清液，二喹啉甲酸法检测样本蛋白总浓度后上样，SDS-PAGE电泳及聚偏二氟乙烯转膜后，加入1∶1000的CD9、CD63、白蛋白、钙连蛋白抗体孵育10h，HRP二抗孵育30min，化学发光液显色、曝光后，Image-J软件计算蛋白条带相对灰度值，以鉴定Exos特异性表面分子表达。

1.2.3血清Exos的标记与摄取:取50μL血清Exos悬液，用PKH67染液(按染液说明书进行，胞膜标记Diluent C稀释液250μL，DYE染液1.5μL)染色10min以标记Exos，MW3000纯化液纯化Exos，DMEM完全培养基重悬稀释后，加入到HNSCC细胞系-AGZY-973细胞培养上清液中，培养24h后，取AGZY-973细胞，4%多聚甲醛固定40min，曲拉通破膜，DAPI染核后，激光共聚焦显微镜观察Exos摄取情况。

1.2.4RT-PCR法检测Exos悬液中miR-96-5p的水平:取50μL Exos悬液，用RNA提取试剂盒提取RNA，反转录试剂盒反转录得到cDNA，按qRT-PCR试剂盒进行PCR反应(反应条件：95℃预变性40min、95℃变性80s、65℃退火80s、72℃延伸30min，40个循环)。miR-96-5p以U6为内参，用2-ΔΔCt法计算miR-96-5p表达水平。miR-96-5p引物序列(F：5’-TTTCTTGTCGGTATTGA-3’，R：5’-ATTCAGAACGCAGTG-3’)由大连宝生生物公司合成。

1.2.5血清Exos对AGZY-973细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响:取AGZY-973细胞，常规复苏、培养、计数后，以1×105个/孔的密度接种于6孔板中，设置为：Control组、HNSCC患者血清Exos组、健康对照者血清Exos组，每组设置6个复孔；Control组加入DMEM培养基正常培养，HNSCC患者血清Exos组在Control组基础上加入50μL的HNSCC患者血清Exos悬液进行培养；健康对照者血清Exos组在Control组基础上加入50μL的健康对照者血清Exos悬液进行培养。各组细胞培养0、24、48及72h后，取细胞，向细胞中加入10μL的CCK-8溶液继续培养2h，450nm紫外分光光度仪上检测吸光度(OD)值，并绘制生长曲线，以检测细胞增殖。取培养72h后的细胞，行AnnexinV-EGFP/PI染色后，流式上机检测计算细胞凋亡率。取处理培养72h后的细胞，无血清培养基饥饿12h后并调整细胞密度至1×105个/mL，取200μL细胞悬液加入Transwell小室上室，小室下室加入400μL培养液，24h后取出下室，棉签擦去室内细胞，甲醇固定、结晶紫染色后，置于光镜下观察及拍照，随机取5个视野，计数细胞数目，即为迁移数目，Transwell小室内表面铺100μL 0.25μg/μL的基质胶(Matrige)，其余同上述步骤，检测侵袭数目。取处理培养72h后的各组细胞，粉碎、匀浆液后，提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取50μg样品行电泳、电转膜操作，滴加1∶900的兔抗人FoxO1、Bax、Bim、p21一抗抗体，及1∶1000的β-actin内参抗体，4℃避光孵育24h，滴加羊抗兔1∶1900的HRP二抗孵育70min，增强化学发光法显色，Image-J软件计算蛋白条带相对灰度值。

1.2.6双荧光素酶报告试验验证miR-96-5p与FoxO1的靶向关系:通过starbase网站预测miR-96-5p与FoxO1存在互补配对的碱基序列。建立含有miR-96-5p结合位点的FoxO1-3'UTR野生型(WT)和突变型(MUT)片段，并分别克隆至荧光素酶报告质粒中，以合成FoxO1-3'UTR-WT及FoxO1-3'UTR-MUT，用Lipofectamine 3000转染试剂在293T细胞中共转染mimic NC或miR-96-5p mimic，共转染48h后，用双荧光素酶报告分析系统检测荧光素酶活性。

1.2.7裸鼠荷瘤试验验证血清Exos对AGZY-973细胞生长及FoxO1调控的影响:取100μL的HNSCC患者血清Exos，重悬后，BCA法测Exos蛋白浓度，将400pmoL Cy3标记的miR-96-5p抑制物(miR-96-5p inhibitor)及其阴性对照(inhibitor-NC)、FoxO1过表达质粒(pcDNA-FoxO1)及其阴性对照(pcDNA-NC)，分别与40μg蛋白在无菌PBS中混合，加入氯化钙溶液(0.1moL/L)，用PBS调整体积至400μL，4℃冰上放置5min，120000×g速度离心70min，提取Exos，得到Exos-miR-96-5p inhibitor及Exos-inhibitor-NC、Exos-pcDNA-FoxO1及Exos-pcDNA-NC外泌体，并分别与AGZY-973细胞共培养24h后，取细胞，4%多聚甲醛固定20min，曲拉通透化10min，5μL的鬼笔环肽(Alexa Fluor 488)孵育20min标记细胞骨架，DAPI核染，于共聚焦显微镜下观察拍照，以判定Exos对miR-96-5p、FoxO1信号的传递作用。取纯种裸鼠，设置为：Control组、Exos组、Exos-miR-96-5p inhibitor组、Exos-inhibitor-NC组、Exos-pcDNA FoxO1组、Exos-pcDNA NC组，每组6只；Control组AGZY-973细胞加入正常培养基培养48h；Exos组向AGZY-973细胞培养基中加入50μL的HNSCC患者血清Exos悬液；Exos-miR-96-5p inhibitor组及Exos-inhibitor-NC组向AGZY-973细胞中加入Exos-miR-96-5p inhibitor及Exos-inhibitor-NC悬液50μL；Exos-pcDNA FoxO1组、Exos-pcDNA NC组分别向AGZY-973细胞中加入50μL的Exos-pcDNA-FoxO1及Exos-pcDNA-NC培养48h。各组调整细胞浓度为1.0×106个/mL，取0.5mL接种于裸鼠头颈部(口底部位)，14d后裸鼠口底部位可触及瘤块，视为接种成功，28d后，处死裸鼠，剥离瘤体，用游标卡尺测瘤体体积(瘤体体积=长径×短径2/2)。

2 结 果

2.1血清Exos鉴定结果:透射电镜显示血清Exos有完整膜，形态呈杯口状，直径为30～120nm，内有低电子密度小颗粒，见图1A。Western blot结果显示，HNSCC患者血清Exos及健康对照者血清Exos中CD9及CD63高表达，白蛋白低表达，内质网来源的钙连蛋白不表达，提示具有膜结构的Exos并非来源于细胞碎片，证实Exos提取成功，见图1B。NTA结果显示各组Exos悬液粒度分布曲线重合度较高，各组exosomes样本表观均一性无明显差异，见图1C。免疫荧光双染结果显示，PKH67绿色荧光标记的Exos可被HNSCC细胞系(AGZY-973)摄取，见图1D。RT-PCR结果显示，与健康对照者血清Exos组相比，HNSCC患者血清Exos组中miR-96-5p表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1、表1。

图1 血清Exos鉴定结果图

表1 血清Exos中miR-96-5p表达变化

2.2血清Exos对AGZY-973细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移的影响:与Control组相比，HNSCC患者血清Exos组AGZY-973细胞在24h～72h后增殖加快，且在72h时增殖率差异最明显，细胞凋亡率降低，迁移数目、侵袭数目升高，差异有统计学意义(P<0.05)；健康对照者血清Exos组上述指标变化与Control组相比差异无统计学意义(P>0.05)，见图2～4、表2。

图2 细胞增殖曲线图

表2 各组细胞凋亡率迁移及侵袭数目表达比较

2.3血清Exos对AGZY-973细胞FoxO1、Bax、Bim、p21蛋白及miR-96-5p表达的影响:与Control组相比，HNSCC患者血清Exos组细胞中FoxO1及Bax、Bim、p21蛋白表达均降低，miR-96-5p表达均升高，差异有统计学意义(P<0.05)；健康对照上述指标变化与Control组相比差异无统计学意义(P>0.05)，见图5、表3。

表3 各组细胞FoxO1及Bax Bim p21蛋白及miR-96-5p表达比较

图3 流式细胞凋亡图

图4 细胞迁移、侵袭图(×100)

图5 FoxO1及Bax、Bim、p21蛋白表达免疫印迹图

2.4miR-96-5p对FoxO1靶向调控的影响:Starbase数据库预测发现FoxO1与miR-96-5p之间有靶向结合位点。双荧光素酶报告试验结果显示，共转染miR-96-5p mimic和无突变的FoxO1-WT载体，可使293T细胞中荧光素酶活性显著下降，差异有统计学意义(P<0.01)；而共转染miR-96-5p mimic和发生突变的FoxO1-MUT载体对荧光素酶活性无显著作用，差异无统计学意义(P>0.05)，见图6。

图6 双荧光素酶验证图

2.5血清Exos对FoxO1的调控作用研究:免疫荧光双染结果显示，与Exos-inhibitor NC相比，Exos-miR-96-5p inhibitor与AGZY-973细胞共培养后CY-3红色荧光表达增高，提示Exos中miR-96-5p inhibitor可被传递至AGZY-973细胞，见图7。裸鼠荷瘤试验显示，与Control组相比，Exos组瘤体体积、瘤体重量升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与Exos组相比，Exos-miR-96-5p inhibitor组及Exos-pcDNA FoxO1组瘤体体积、瘤体重量降低，差异有统计学意义(P<0.05)，说明抑制Exos中miR-96-5p表达或上调Exos中FoxO1表达可部分逆转Exos发挥的促瘤体增长作用，见表4、图8。

图7 免疫荧光双染图(×1000)

图8 裸鼠移植瘤直观比较

表4 各组裸鼠瘤体体积瘤体重量比较

3 讨 论

HNSCC局部复发率高，发病率约占全身肿瘤的1%～5%，是当今最普遍发生的肿瘤之一[9]。迄今为止，临床上仍缺乏诊断局部复发和治疗效果的生物标志物，这是导致HNSCC五年生存率不高的原因[10]。miRNA被认为是癌症筛查、诊断和预后最具特异性的生物标志物。文献报导发现，致癌基因miR-96-5p可在HNSCC癌组织中高表达，并能通过携带突变基因TP53及P53蛋白而促进HNSCC细胞迁移、产生放化疗抗性，在HNSCC诊断及预后过程中有潜在价值[5]。但HNSCC位置隐蔽，组织活检也极为不便，HNSCC组织中miR-96-5p诊断限制性较大。

肿瘤自身可释放Exos进入体循环，邻近组织或细胞可通过内吞方式摄取Exos，来完成Exos中蛋白质、脂质、miRNA等信号分子的传递，且Exos的双层脂质包围结构，也使得母本遗传信息miRNAs分子如miR-96-5p、miR-363-3p、miR-17-5p、miR-21等极难被机体降解，而使诊断稳定性、准确性较高[11]。血清Exos中miR-96-5p也因其稳定性、无创性，已被用作酒精性脂肪肝疾病的诊断[12]。王宁等[13]发现胃癌患者血清Exos向胃癌细胞传递miR-223，而导致胃癌增殖、侵袭、迁移等恶性生物生物学行为进一步加重。本研究在HNSCC患者血清中提取到双层膜结构、直径约为100nm的Exos，通过基因测序发现Exos中高表达miR-96-5p，HNSCC细胞系-AGZY-973内吞血清Exos后其细胞中miR-96-5p表达进一步升高，细胞增殖、侵袭、迁移能力也较Control组及健康对照者血清Exos组进一步增强，另外，HNSCC患者血清Exos转染荧光标记的miR-96-5p低表达质粒，与HNSCC细胞共培养后，可见荧光标记的miR-96-5p低表达质粒被Exos包裹并传递至HNSCC细胞，HNSCC细胞瘤体体积增长也最缓慢，提示HNSCC患者血清Exos可能向HNSCC细胞传递遗传miR-96-5p信息，而促进HNSCC恶性生物学发展。

FoxO1在正常组织中表达量维持在一定水平起到“监管”细胞周期的作用。近来研究发现，FoxO1在食管癌、胃癌、肝癌等多种癌组织中低表达，且已被公认为重要的抑癌因子[14]。Zhao等[15]发现上调FoxO1表达可将口腔鳞状细胞癌细胞周期阻滞在G1期而抑制其增殖，并影响促凋亡蛋白Bax、死亡调解子(Bim)、凋亡蛋白p21表达，而促进其凋亡、抑制其扩散。本研究发现，miR-96-5p与FoxO1之间有靶向调控作用，HNSCC患者血清Exos促进HNSCC细胞高表达miR-96-5p、加剧恶性生物学行为产生的同时，也降低FoxO1及Bax、Bim、p21等促凋亡因子表达而抑制凋亡，提示HNSCC患者血清Exos传递miR-96-5p，促进HNSCC增殖、迁移及侵袭作用，可能与靶向下调抑癌基因FoxO1有关。为了进一步验证这一推测，本研究用裸鼠荷瘤试验验证发现，HNSCC患者血清Exos转染FoxO1高表达质粒，可明显减弱其发挥的促瘤体体积生长作用。

综上所述，HNSCC患者血清Exos传递出的miR-96-5p下调FoxO1水平，导致HNSCC细胞增殖、侵袭、迁移、生长等恶性生物学行为的发展。研究结果对HNSCC无创诊断及新型治疗策略提供一定借鉴作用。但HNSCC外泌体遗传信息背景复杂，miR-96-5p是否与其他调节性的非编码RNA(Lnc、Circ等)发生交互作用需要更深入的研究。