高 欢,徐小艳∗,陈韵宇,刘鸿艳,陈 亮,杨万能,罗利军,楼巧君∗∗

(1上海市农业生物基因中心,上海 201106;2华中农业大学,武汉 430070)

随着世界人口快速增长,气候等环境条件不断变化,粮食生产面临严峻挑战[1]。水稻是我国的主粮之一,目前我国水稻生产主要面临三个重大问题:一是水稻生产用水占总用水量的50%以上,而我国又是缺水大国[2];二是日益频繁的干旱导致水稻严重减产[3];三是在田间长期保留水层的种稻方式随着农药化肥施用量的增加,形成严重的面源污染,同时导致大量的温室气体甲烷排放[4]。节水抗旱稻是结合了水稻的高产优质和旱稻的节水抗旱特性而育成的一种新的栽培稻品种类型。其栽培简单易行,既可像水稻一样在水田淹水栽培,又可像小麦一样在旱地直播种植,既节能又环保。因此,发展节水抗旱稻,可改变水稻传统栽培方式,是实现“资源节约、环境友好”农业绿色发展方式的重大需求,是今后可持续农业发展的方向[5]。

近年来,随着测序技术的飞速发展,上万份水稻种质资源的基因组和转录组测序已经完成,多个水稻抗旱相关基因的功能已得到解析,然而能真正用于种质创新,有效提升品种抗旱能力的基因却鲜有报道,主要原因是水稻抗旱性极其复杂,由于缺乏抗旱表型精准鉴定平台,导致对基因序列信息的发掘利用不足。目前水稻表型性状信息获取主要依靠人工完成,存在效率低、精度差、主观性高、误差大和重复性差等缺点,并且有些指标需要剪取作物器官进行有损测量。因此,迫切需要建立高通量的抗旱表型平台。与传统人工表型测量相比,高通量表型平台不仅具有高效准确等优点,还可实现全生育期的无损测量,实现高通量表型信息并行获取和统一数据库化管理与分析。

作物表型组学是系统研究作物或细胞在不同环境条件下所有表型的新兴交叉学科,涵盖作物多尺度、多维度的全方位表型性状数据。在生物学和遗传育种领域,表型组是指某一生物的全部性状特征,不仅局限于农艺性状,还包括植株所表现出来的生理状态及生化组分[6-7]。利用自动、高效的高通量表型平台是获取作物表型组数据的有效手段,有利于在可控环境下系统揭示基因组与环境等因素互作进而调控作物表型的分子机理。目前,根据应用场景的不同,高通量表型组学研究平台可以分为温室型及田间表型平台两大类[8]。温室型表型组学设施主要采集和分析可控环境条件下植物或作物的表型信息,通过整合分析环境条件,匹配基因组学和表型组学数据,最终实现“自动育种、智能育种”。大部分温室型表型平台都采用传送式(Plant to sensor),如澳大利亚植物表型加速器和德国Julich中心表型平台等[9]。田间表型平台以轨道式居多(Sensor to plant),如英国洛桑实验站的田间表型平台,搭载了可见光、红外、激光3D、叶绿素荧光、高光谱和CO2检测等多个传感器,利用一个可移动机械手臂进行数据采集,已应用于油菜和小麦等作物不同营养处理下相关田间表型研究[10]。

我国的表型组学设施建设起步较晚,中国科学院、中国农业科学院和华中农业大学等单位率先建立了一些以盆栽试验为主的表型检测系统[11]。上海市农业生物基因中心于2020年建成节水抗旱稻表型组学研究平台(以下简称WDR表型平台),其基本原则是在接近大田条件下,最大限度地实现水稻干旱胁迫处理,通过科学管理减少环境误差,进而连续监测群体的生长动态与表型变化。本研究结合国内外水稻抗旱表型组学研究平台建设和应用方面的进展,详细介绍节水抗旱稻表型平台各采集单元的技术与应用。

1 表型平台基础设施

随着高通量表型组学技术的兴起,国内外投入运行的大型表型设施已有一百多套[11]。CropDesign(比利时Overijse)开发了第一个高通量表型分析平台,命名为Trait Mill平台,该平台携带RGB摄像头,可用于测量作物的生物量、植物形态和颜色等表型性状,用于禾谷类产量基因及其功能研究和利用[12]。从技术开发上看,目前国际上最著名的表型平台是德国LemnaTec公司研发的“全自动高通量植物3D成像系统”(Scanalyzer 3D;Automated PhenoAIxpert HT),该系统采用可见光成像技术、红外热成像技术、高光谱成像技术和荧光成像技术,可对玉米、大麦等农作物实现高通量表型观测和自动分析[13]。

WDR表型平台由温室、抗旱鉴定岛(池)和数据采集系统组成。温室总占地4 608 m2,分6跨,单跨宽8 m,长96 m,肩高4 m,顶高6 m,实际可种植面积约2 666 m2,能同时进行40 000多株水稻植株的抗旱鉴定。按照抗旱性分类鉴定要求,温室分成3个功能区域:(1)耐旱性鉴定区:占地2跨,在30 cm的土层下铺设了防水膜,尽量降低由根系造成的避旱性差异(图1左);(2)综合抗旱性鉴定区:占地3跨,为保证形成土壤水分梯度,地块两边建有1.2 m深的水沟,中间安装供水系统(图1中);(3)避旱性鉴定区:占地400 m2,建有6个水培池,可同时进行1 296个篮子的培养,配备营养液自动控制系统(图1右)。

图1 节水抗旱稻表型组学研究平台温室布局示意图Fig.1 Layout of the greenhouses of the water-saving and drought-resistance rice(WDR)phenomics platform

综合抗旱鉴定区采用土壤水分梯度抗旱鉴定岛方式修建,每份材料种植成长行小区,小区内实现水旱对比种植(图2)。从鉴定岛中间有水一侧到边上无水一侧,形成连续的土壤水分梯度,从而保证水旱处理之间除了土壤含水量不同之外,其他环境条件完全一致。抗旱温室还配备了风机和水帘,能够较好控制棚内的温度和湿度。温室内外都配置小型气象站,可以连续记录试验期间的空气温湿度、光照、降水量和风速等气象指标。早在2002年和2006年,上海市农业生物基因中心已先后在上海青浦重固基地、白鹤基地,按照同样模式设计和建设抗旱鉴定连栋大棚或玻璃温室,多年的试验结果证明了这种方式是进行群体旱胁迫鉴定的最理想模式之一[14,22]。

图2 抗旱鉴定岛土壤水分梯度形成示意图Fig.2 Schematic diagram of soil water gradient development in drought resistance screening island

温室内耐旱性和综合抗旱性鉴定于田块上方进行,建设了5跨自动化表型图像采集系统。系统的总体结构包括智能导航车、远程终端控制模块、工作站、图像采集和分析模块。导航车上搭载了4种光学成像传感器:RGB成像、红外热成像、高光谱相机和激光雷达,可以在横向和纵向精准定位并采集水稻地上部分图像信息;远程终端控制模块主要用于实现远距离控制导航车精准定位和图像采集。

完成采集后,图像传输至工作站,通过分析软件提取并转换成相应的表型参数,进一步进行抗旱性综合评价(图3)。

图3 WDR表型平台检测示意图Fig.3 The workflow of the WDR phenomics platform

图4展示了WDR表型平台4种图像采集单元在田间的分布情况,每跨上面都有一个龙门架,所有的相机都挂载在龙门架上。龙门架加轨道组成一个智能导航车,可以带动相机在X轴(不同小区种植的方向,图4左图长箭头所指的方向)、Y轴(同一小区不同水分梯度的方向,图4中图长箭头所指的方向)以及Z轴(龙门的竖直方向,用来调节相机和植株之间的高度)上精确移动,找到目标位置后进行精准扫描。

图4 WDR表型平台传感器阵列Fig.4 The array of sensors in the WDR plant phenomics analysis platform

2 技术应用

2020年夏季,在抗旱鉴定岛种植了一套水稻抗旱核心种质群体共270份,每个材料设置3个生物学重复,利用该自动化表型设施开展抗旱鉴定和表型扫描。抗旱表型扫描从7月到9月,持续了近3个月,采集了几十个TB的表型数据。试验目标是连续无损地监控水稻旱胁迫下的表型动态变化,挖掘新的抗旱敏感图像特征,结合基因型挖掘关键抗旱基因,最终辅助抗旱育种。下面以这次试验的数据和结果作为实例进行展示和讨论。

2.1 可见光成像单元

可见光(RGB)传感器是一种把可见光波长范围反射信号作为检测和图像采集源的设备,可以拍摄含有植物大多数形态特征的图像,获取植物株高、生物量和颜色等表型性状[15],因其性价比较高,在大量表型平台中获广泛应用[16]。Liu等[17]使用RGB图像估算小麦植株密度实现产量预测;Crimins等[18]通过定时成像设备采集植物表型的时间变化进程;Deery等[19]通过RGB图像,分析植株的形态、紧凑度等参数,获取响应水分胁迫的相关信息。

WDR表型平台每跨的龙门上装载了3台角度不同的RGB相机,整个平台配置了15台RGB相机。表1展示了利用WDR表型平台的RGB单元可获取的表型参数。除了形态、颜色和纹理等常规的RGB图像特征,针对抗旱性研究的目标,本平台RGB单元可提取的表型参数增加了卷叶程度、持绿程度和枯死叶比例等抗旱密切相关的性状。与单台可见光RGB相机相比,不同视角的可见光图像可通过类似双目视觉的方式获取准确的株高和叶片角度等表型性状。

表1 RGB单元检测的表型参数Table 1 Phenotypic parameters detected by RGB camera

如图5所示,同一个材料从中间有水一侧到边上无水一侧,形成连续的旱胁迫梯度,株高、生物量等呈逐渐递减的趋势,开花期也表现为逐渐延迟的趋势。

图5 2020年鉴定岛上植株响应土壤水分梯度效应的表现(断水后40 d)Fig.5 Plants’field performance responding to soil water gradient in the greenhouse in 2020(stop irrigation for 40 days)

与盆栽水稻侧重于单株的图像分割不同,田间水稻小区更关注对植株整体冠层图像的分割,以此来计算特定区域内植被覆盖度、持绿性(Stay-green)等性状。在干旱鉴定试验中,持绿性指植株对抗干旱胁迫导致的叶片枯死的能力[20],常被用作衡量叶片抗旱能力[21]。除了持绿性以外,水稻冠层的形态学特征也能反映出水稻在干旱胁迫状态下的表现。根据水稻小区的颜色、形态及纹理特征,提取出35个可见光图像性状。随着水分梯度的形成,试验区域从干到湿分成5个区块,植株的生物量和颜色呈现显著梯度变化,最左侧区域土壤含水量最低,命名为胁迫组,其生物量最小、株高最低;最右侧区域土壤含水量最高,命名为对照组,其生物量最大、株高最高(图6)。

图6 不同水分梯度下植株的可见光图像变化Fig.6 Changes of visible light images of plants under different moisture gradients

可见光成像能较好地获取大田小区水稻抗旱表型性状。提取群体的胁迫组(干旱)和对照组(湿润)的可见光表型参数,共获得35个图像性状,分别进行水旱成对t检验,其中有18个性状表现出极显著差异。表2列举了其中水旱差异最显著的10个图像性状,其中亮度分量均一指数(U_L)、绿色分量均一指数(U_G)和绿色投影面积占比(GPAR)等图像性状在水旱处理之间差异最为显著,是进行抗旱研究时应重点关注的可见光表型图像性状。

表2 可见光表型参数水旱对比差异分析Table 2 The difference of the RGB image traits between the drought treat and the normal control

2.2 热红外成像单元

所有高于绝对零度(-273℃)的物体都会发出红外辐射。红外热像仪利用光电设备来检测辐射,在辐射强度与表面温度之间建立关系模型,从而将物体发出的不可见红外能量转换为可见的不同颜色的热伪彩图像。

冠层温度是指植物茎、叶、穗表面温度的平均值,不仅与气温、地温、光照强度、土壤湿度、空气湿度和风速等自然条件关系密切,还与植物自身的基因型、生育期和水分状况紧密相关,在作物抗旱研究中的应用已有较多报道。刘鸿艳等[22]利用红外测温仪测量冠层温度进行水稻抗旱性基因型筛选;梁银丽等[23]研究了冬小麦在不同土壤水分条件下拔节到抽穗期的冠层温度-气温差变化规律,发现作物在充分供水条件下,冠层温度-气温差变化较平缓,而缺水时变化较大,因此冠层温度-气温差可较合理反映土壤水分变化状况和作物水分亏缺程度。

红外热成像探测能力强,作用距离远,能持续直观地显示物体表面的温度,可用于作物冠层温度快速测量。WDR表型平台每跨的龙门上均匀装载了8台红外热成像仪,整个平台配置了40台红外成像仪,完成同一跨群体材料的红外扫描,仅需20 min;温室内外小型气象站和土壤温湿度探头记录的同时期环境和气象数据提供实时参照,可有效提高群体材料之间冠层温度测量的稳定性和准确性。图7展示了热红外图像的获得过程,首先把获取到的原始红外图像归一化为像素值范围为0—255的灰度图,使用最大类间方差(OTSU)算法进行水稻冠层图像分割;再用分割图对原始红外图做掩膜处理,并对掩膜区域求取平均值,由此获得该水稻冠层的平均温度。比较发现,同一材料的水旱处理之间冠层温度差异显著,旱处理区域的冠层温度显著高于有水区域。该结果与预期吻合,缺水会降低植物的蒸腾作用,从而减弱植物调节冠层温度的能力。

图7 红外图像处理过程Fig.7 The treating process of infrared thermal images

2.3 高光谱成像单元

高光谱成像技术是基于非常多窄波段的影像数据技术,它将成像技术与光谱技术相结合,探测目标的二维几何空间及一维光谱信息,获取高分辨率的连续、窄波段的图像数据。根据扫描方式,分为点扫描和线扫描:点扫描是一次获得一个点的光谱数据;线扫描是一次获得一条线上的光谱数据,它的成像设备是光谱仪和灰度相机,分辨率高,成像较快,目前应用最多。

随着光谱和大数据分析技术的进步,高光谱在农业方面的应用越来越普遍。通过高光谱扫描能够有效反映植物的生理和生化参数,如光合作用速率、土壤覆盖状况、氮状况、水分指数和其他各种光谱反射指数(SRI),最终用于抗旱性评价[24-27]。

WDR表型平台每跨的龙门上都装载了1台高光谱成像仪,整个平台配置了5台高光谱成像仪,完成整跨群体扫描大概需要7 h。为了避免日光的影响,高光谱的扫描一般在晚上进行。本平台的高光谱成像仪获取的是400—1 000 nm光谱的反射率。根据“线扫宽度×线扫数量×波段”可构成一个三维数组,提取某个波段的图像进行可视化分割,按照土壤水分梯度分成若干区块,分析不同区块的不同波段的光谱信息,分析流程见图8。本平台应用神经网络(U-Net)算法对高光谱图像进行穗叶分割,分割效果较好(图9)。在已完成试验中,也发现高光谱某些波段与叶片含水量等抗旱指标高度相关,可以作为抗旱筛选的有效指征,例如500 nm左右的某些波段,可以较好地区分抗旱和旱敏感材料,可作为早期抗旱性筛选的指标(数据尚未发表)。

图8 高光谱数据处理流程Fig.8 The treating process flow of hyperspectral data

图9 高光谱图像的穗叶分割Fig.9 Rice panicle and leaf splitting of hyperspectral image

2.4 激光雷达单元

激光雷达(Light detection and ranging,LiDAR),是一种主动式、通过捕获目标的散射光,分析反射光来测量目标物体的距离,从而获取相关目标信息的光学遥感技术[28]。它的优点:具有极高的分辨率;抗干扰能力强;获取的信息量丰富;可全天候工作[29]。随着技术的发展,激光雷达已经开始应用于作物表型组学的各个方面,通过激光雷达可获取冠层和叶片的各种参数,如植被覆盖、高度、冠层结构、叶面积指数和氮状况等[30-34]。

WDR表型平台每跨的龙门上都可装载激光雷达,根据不同的精度设置,完成整跨群体扫描的时间约为2—4 h。激光雷达的扫描不受光照的影响,但受风速影响较大,风速较大时会引起植物摇晃,造成植株点云分析困难。本平台在密闭的温室内,几乎不受风的影响,从而保证了检测的准确性。利用本平台激光雷达获取的点云数据分析冠层高度,发现植株生长过程的冠层高度逐渐增大,至8月14日左右基本稳定,而此时正是群体材料抽穗较为集中的时期,说明用激光雷达进行冠层高度检测是可靠的(图10)。除此之外,植株的冠层面积、光截获面积、叶片夹角等重要农艺性状,也可通过激光雷达获取。激光雷达可获得的数据量远超前面其他种类的采集设备,因此数据分析的难度较大,具体到每个性状如何分析还在进一步摸索之中。

图10 激光雷达检测冠层高度Fig.10 Rice canopy height detected by LiDAR

3 结论与展望

WDR表型平台以华中农业大学杨万能教授等自主研发的表型装备为基础[35],结合了抗旱鉴定温室+自动化高通量表型检测技术,在温室可控环境下内建设自动化龙门轨道,装配可见光、红外、高光谱和激光扫描雷达等多元检测装备。在一个种植小区内实现不同水分梯度处理,实现对整个群体的水分精确控制,可进行综合抗旱性和耐旱性的全生育期表型无损动态监测。在检测通量上也有显著提升,是国内外通量最大、配备最齐全的水稻抗旱表型研究平台。

经过一年的预试验证明,WDR表型平台可获取很多有效的与水分胁迫反应相关的图像表型数据,如温度、冠层、生物量、叶片颜色形态等基于图像的性状,这点在以往不同作物研究中也有论述[36-37]。但是基于数字图像提取水分胁迫后相应的图像特征(i-traits),有些无法与传统的水稻抗旱农艺性状直接对应,如何正确解读i-traits,挖掘出真正对抗旱功能基因组研究有价值的量化性状,是水稻抗旱表型组学发展的关键所在[38]。同时,由于表型采集技术的快速发展,即使只针对单个物种,全表型测量也会产生海量数据集。在今后相当长的时间内,图像分析及数据解析方法仍然是新一代植物表型组学发展的瓶颈[11],因此,认为只要购买了先进表型仪器就能完成整个表型组测量、数据分析和生物信息挖掘等,是对表型组学研究的误解[39]。

抗旱表型组学作为一个“组学”的范畴,其全面分析的潜力还体现在其与其他组学研究的结合上[40]。表型组学可同时整合基因组、代谢组和转录组等多组学数据,以及考虑环境和管理因素,对植物的细胞、组织、器官、个体、群体等不同尺度及不同生长发育时期进行综合分析,全面提升作物表型精准鉴定能力,绘制作物抗旱响应完整的调控网络,促进水稻育种模式和育种理念的变革,实现育种过程的设计性、预见性和可控性,为智能高效育种提供新的可能和思路。