■张树泽 王常安 陆绍霞 刘思源 王亚玲 刘红柏 杨雨虹 徐奇友

（1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江哈尔滨 150070；2.东北农业大学动物科学技术学院，黑龙江哈尔滨 150030；3.湖州师范学院，浙江湖州 313000）

肌醇（myo-inositol, MI）存在于生物体内的各种组织如肝脏、肾脏和脑中，由L-肌醇-磷酸合成酶催化，通过葡萄糖-6-磷酸环化成肌醇-1-磷酸，然后通过肌醇-1-磷酸酶进行去磷酸化生成[1]。在体内主要以磷脂酰肌醇的形式作为生物膜结构的组分发挥着重要作用[2]。肌醇作为维持水生动物正常生理功能必需的营养素之一，与水溶性维生素相似，如生物素、维生素B1，肌醇可以促进水产动物机体发育，还能降低血脂，促进脂肪代谢[3-4]，被广泛应用于水生动物饲料中，对鱼类的主要作用表现为提高饲料利用率，加快鱼类生长，促进肝脏和其他组织中的脂肪代谢[5]。肌醇不足会引起养殖鱼类脂质代谢紊乱，降低抗氧化、非特异性免疫能力和对病原菌的抵抗力。目前，国内外对于肌醇的研究已经在牙鲆（Paralichthys olivaceus）[6]、奥尼罗非鱼（Oreochromis niloticus×Oreochromis aureus）[7]、尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）[8]、建鲤（Cyprinus carpio var. jian）[9]等养殖鱼类中展开，在施氏鲟中还未见报道。

施氏鲟在自然条件下主要分布于黑龙江水系中，是黑龙江地区特有的经济鱼类之一，是我国鲟鱼中最具有经济价值的优质珍稀鱼类。鱼体细长呈细纺锤形，裸露无鳞，背有5行大的菱形骨板，幼鱼骨板带有尖棘，为软骨硬鳞鱼。其身体背部呈棕灰色或褐色，幼鱼为黑色或浅灰色，腹部均为白色。施氏鲟生长速度快，鱼肉脂肪少，无刺，脊椎骨是软骨，是具有非常高价值的食用鱼类。根据2021年《中国渔业统计年鉴》[10]记录2020年鲟鱼的总产量为104 280 t，中国已经成为世界第一鲟养殖大国[11]。但规模化的养殖并没有专业的饲料作为基础，尤其是饲料的基础配方方面更是缺乏细致的研究。目前的研究对于鲟蛋白质[12]、脂肪[13]、碳水化合物[14]等营养成分的需求已经基本确定，但肌醇对于施氏鲟的作用未有报道。本试验研究饲料中不同肌醇水平对施氏鲟消化系统组织结构及消化酶活性的影响，为其饲料的配制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试验设计

以酪蛋白和明胶为蛋白质来源配制肌醇（阿拉丁，浓度99%）水平为28.75、127.83、343.83、565.81、738.15 mg/kg和936.28 mg/kg（分析值）的6种试验饲粮（G1、G2、G3、G4、G5、G6组），基础饲料配方及营养水平见表1。干燥的原料通过60目筛（250 μm），在饲料搅拌机中彻底混合后均质。此外，鱼油90 g/kg 和适量的水添加到配料中，饲料混合物用制粒机（HX-200G，长沙广和仪器公司）实验室制粒。粒径1.0 mm，饲料在55 ℃的烘干机中干燥，直到水分含量减少到80～100 g/kg，密封在塑料袋中，-20 ℃冰箱保存待用。

表1 基础饲料配方及营养水平(风干基础）

1.2 试验鱼饲喂与管理

试验鱼暂养14 d 后开始正式养殖试验。鱼饥饿24 h 后，采用完全随机分组，将平均体重为（11.90±0.12）g的鱼分为6个处理组的18个水族箱中，每组3个重复。称量每缸鱼总重。每天人工投喂4次（08：00、11：00、14：00、17：00），近饱食。每天记录饲料投喂量。试验在220 L循环水箱中进行，流速约为1.0 L/s，试验持续56 d。试验期间，每天测定水的pH和温度，每周测定溶解氧和氨氮含量。水温为（23.0±0.5）℃，溶解氧为（8.65±0.08）mg/L，氨氮为（0.022±0.006）mg/L，pH为（7.10±0.05）。每天维持光照14 h。试验结束时，将每箱试验鱼饥饿24 h后，测量并记录体重和体长。

1.3 样品采集

试验结束后，用苯氧乙醇（0.05%）麻醉。每处理组每重复随机取4尾鱼用于消化酶分析。于冰盘上分离肝胰腺、瓣肠及前、中肠（剔除内含物和脂肪），生理盐水洗净，滤纸吸干，称重。按1∶9重量体积比（W/V）加入预冷生理盐水，以FJ-200CL高速组织匀浆机匀浆（15 000 r/min，3 min）稀释，4 ℃条件下4 000 r/min 离心10 min，取上清液放入1.5 mL 离心管中，-80 ℃冷冻保存，用于测定前肠、中肠、瓣肠和肝胰腺的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性。

1.4 消化酶活性测定和组织切片观察

消化酶活性：蛋白酶以福林-酚法测定，脂肪酶用聚乙烯醇橄榄油乳化液水解法测定，淀粉酶采用淀粉-碘比色法[14]测定。

组织切片：每重复随机取4尾鱼的肝胰腺、前肠、中肠和瓣肠于Bouin’s液中固定48 h，常规石蜡包埋，用KD1508型切片机对样本进行横向连续切片，切片厚度为6 μm，苏木精-伊红染色法染色，中性树胶封片，Motic光学显微镜下测定前、中、瓣肠的绒毛高度和肌层厚度，每张切片测定10个绒毛高度和肌层厚度。

1.5 统计分析

试验结果用SPSS 19.0 进行单因素方差分析和Duncan’s法多重比较，设置显著性水平P＜0.05。试验数据结果均采用“平均值±标准差（Mean±SD）”表示。根据施氏鲟肠道蛋白酶活性，采用线性回归方程分析确定施氏鲟最佳肌醇添加量，饲料肌醇水平和肠道蛋白酶活性的关系式为y=ax+b，其中y代表蛋白酶活性，x代表饲料肌醇水平。

2 结果与分析

2.1 饲料中肌醇的添加水平对施氏鲟蛋白酶活性的影响（见表2）

表2 饲料中肌醇的添加水平对施氏鲟蛋白酶活性的影响（n=3，U/g prot.）

由表2可知，前肠、中肠、瓣肠和肝胰腺中蛋白酶活性均受到不同程度的影响。其中，前肠蛋白酶活性在G4 组达到最大值，且显著高于G1 组（P＜0.05）。中肠蛋白酶活性在G5 组最高并显著高于G1 组（P＜0.05）。瓣肠中蛋白酶活性在G3组达到最大值且显著高于G1组（P＜0.05）。肝胰腺蛋白酶活性在G4组达到最大值，且显著高于G1组（P＜0.05）。

2.2 饲料中肌醇的添加水平对施氏鲟脂肪酶活性的影响（见表3）

从表3 可知，随着饲料中肌醇含量的增加，施氏鲟肠道和肝胰腺脂肪酶活性呈现不同的变化趋势。一定浓度范围内的肌醇对前肠脂肪酶活性无显著影响（P＞0.05）。与对照组相比，高浓度的肌醇（G6组）添加可显著提高施氏鲟前肠脂肪酶活性（P＜0.05）；高浓度肌醇（G5组和G6组）添加可显著提高施氏鲟中肠脂肪酶活性（P＜0.05）。瓣肠中脂肪酶活性在G5组活性最高，并显著高于其他组（P＜0.05）。肝胰腺中脂肪酶活性在G3组达到最大值并显著高于G1组（P＜0.05）。

表3 饲料中肌醇的添加水平对施氏鲟脂肪酶活性的影响（n=3，U/g prot.）

2.3 饲料中肌醇的添加水平对施氏鲟淀粉酶活性的影响（见表4）

表4 饲料中肌醇的添加水平对施氏鲟淀粉酶活性的影响（n=3，U/g prot.）

从表4 可知，饲料中添加不同水平肌醇，对前肠淀粉酶活性均没有显著影响（P＞0.05）。随着肌醇添加水平的增加，各组施氏鲟中肠淀粉酶活性均显著高于G1组（P＜0.05），并在G6组达到最大值。G3组肝胰腺淀粉酶活性达到最大值且显著高于其他组（P＜0.05）。瓣肠淀粉酶活性在G3组和G2组活性最高，并显著高于其他组（P＜0.05）。

2.4 根据肠道蛋白酶活性确定施氏鲟最佳肌醇需要量（见图1）

图1 施氏鲟肠道蛋白酶活性与饲料肌醇水平线性回归分析

由于在不同肌醇含量条件下，肠道淀粉酶和脂肪酶活性受肌醇影响相对于蛋白酶活性不显著，即饲料肌醇水平主要影响肠道蛋白酶活性，因此根据肠道（前肠、中肠、瓣肠）蛋白酶活性确定施氏鲟的最佳肌醇添加量。

线性回归模型分析表明：当肌醇含量在501.36～729.72 mg/kg时，施氏鲟肠道蛋白酶活性最高。

2.5 饲料中肌醇的添加水平对施氏鲟肠道消化组织形态的影响（见表5～表6、图2）

图2 肝胰腺和肠道组织切片（10×）

由表5和表6可知，随着饲料中肌醇含量的增加，对施氏鲟消化组织形态具有不同程度的影响。其中，前肠绒毛高度在G5 组达到最大值，且显著高于其他组（P＜0.05）。中肠绒毛高度随着肌醇添加量的增加而增加，在G5 组达到最大值。瓣肠绒毛高度随着肌醇添加量的增加呈现先快速增长然后趋于平稳的趋势，在G3 组达到最大值并显著高于G1 组（P＜0.05）。瓣肠的皱壁厚度均随肌醇添加量的增加而呈现先上升后下降的趋势，瓣肠的作用效果比较明显，G2～G6各组皱壁厚度均高于G1组（P＜0.05）。

表5 饲料中肌醇的添加水平对施氏鲟肠道绒毛高度的影响（n=3，μm）

表6 饲料中肌醇的添加水平对施氏鲟肠道皱襞厚度的影响（n=3，μm）

通过肝组织切片可以发现，肝细胞排列整齐，细胞间存在明显界限，细胞核明显（图A、图B）。随着饲料中肌醇含量的增加，细胞间轮廓变得清晰（图C、图D）。肝细胞内空泡化现在逐渐改善，细胞变得饱满。

通过对前肠、中肠和瓣肠的组织切片观察发现，肌醇添加量较多的试验组绒毛发达，肠道绒毛明显密集且没有空泡，上皮细胞结构完成，排列整齐，G2、G3、G5、G6 组的前肠绒毛高度明显高于G1 组（P＜0.05），且排列较为整齐。

3 讨论

3.1 饲料中肌醇的添加水平对施氏鲟消化酶活性的影响

肌醇是动物细胞内磷脂的构成成分，能够在脂肪代谢中起到促进肝脂肪酶分解的作用，并能对蛋白酶、淀粉酶的分解产生积极影响[15-16]。本试验中，随着饲料中肌醇添加水平的增加，中肠、肝胰腺脂肪酶活性、蛋白酶活性、淀粉酶活性均有较不同程度的提高，这一结果与Jiang 等[17]和冯琳等[18]对幼建鲤（Cyprinus carpio var.Jian）的研究结果一致，王雅平[19]在大菱鲆（Scophthalmus maximus）的研究中也取得了类似的结果，但肌醇添加量不同对本试验中施氏鲟前肠脂肪酶和蛋白酶活性影响并不明显，这可能与肌醇对不同鱼类的作用器官不同有关。张美彦[20]在哲罗鲑（Hucho taimen）的研究中发现肌醇缺乏导致胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等酶的活性显著降低，缺乏肌醇的处理组鱼体重和体长明显降低，因此我们推测消化酶活性降低可能与肝胰脏的发育不良有关[21]。本试验结果表明，饲料中添加肌醇有效促进了肝胰腺和肠道中淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶的分泌，进而提高了施氏鲟对体内脂肪和蛋白的分解效率。这可能与肌醇改变了肠黏膜的形态结构，改善了肠道脂肪转运的过程有关[22]。哲罗鲑脂肪酶的含量也伴随肌醇的增加而显著升高。也有研究表明饲料中添加肌醇能够促进幽门盲囊和肠道中蛋白酶和脂肪酶的分泌，从而有助于哲罗鲑对蛋白质和脂肪的分解，提高其对饲料的消化吸收能力[23]。Yone[24]报道，红鲷（Red snapper）血清中肌醇储存提高胆碱酯酶的活性，进而提高了淀粉酶的活性。与其他试验结果不同的是，在对大西洋鲑[25]（Salmo salar）的研究中发现，肌醇的添加量并不影响大西洋鲑的消化酶活性，这可能是由于大西洋鲑中存在L-肌醇-1-磷酸合成酶和L-肌醇-3-磷酸合成酶，自身合成肌醇的能力已经足够，不需要进行外源添加[26]，这在Burtle 等[27]对斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）和Boonyaratpalin等[28]对黑鲈（Micropterus salmoide）研究结果一致。综上，日粮中适量的肌醇有助于施氏鲟体内消化酶的分泌，对施氏鲟体内消化具有促进作用。

3.2 饲料中肌醇的添加水平对施氏鲟消化系统组织的影响

肌醇能够改善鱼类肠道健康，促进鱼类消化系统的发育[29]。肠道是鱼类进食后消化吸收的重要器官，其绒毛形态和肌层厚度将影响鱼类的消化吸收能力[30-31]。肠道消化吸收能力通过肠组织绒毛的增长、上皮细胞的数量增多、增加消化和吸收的面积来提高[32]。饲料中添加肌醇后，肠道绒毛高度升高，但是随着肌醇含量的增加，绒毛的高度呈现平稳的趋势，这可能是由于肌醇的含量达到饱和，多余的肌醇并不能对肠道绒毛的生长起到作用导致。已有研究表明，肌醇缺乏会导致幼建鲤肝胰脏重量和肝胰脏蛋白质含量的降低，从而降低了幼建鲤的消化能力[33]。这可能与肌醇含量降低时幼建鲤肠道中嗜水气单胞菌数量上升、有益乳酸杆菌含量降低有关[34]。也有报道称，饲料中添加不同水平的肌醇后，建鲤的肠、肝胰脏功能得到了明显的改善，这与本试验产生的结果具有相似的特征[35]。张旭等[36]在尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）饲料中添加维生素E后发现，其显著改善了雌性尼罗罗非鱼肠道组织形态结构，绒毛宽度显著提高，对雄性尼罗罗非鱼的生长和消化也具有明显的促进作用。在团头鲂（Megalobrama amblycephala）以及军曹鱼（Rachycentron canadum）的研究中也得到了相似的结论，适量的肌醇添加量可降低脂肪含量，从而能够有效防止脂肪肝的发生，饲料中肌醇含量对军曹鱼的肝脏肌醇储存产生了显著影响，随着饲料中肌醇含量的降低，肝脏蓄积量也呈现明显降低的趋势[37]，当饲料中肌醇缺乏时，军曹鱼肝脏脂肪代谢会受阻，提高肌醇含量后，其肝脏的脂肪会逐渐减少到正常水平。综上，饲料中添加适量肌醇可改善施氏鲟绒毛形态和皱襞高度，进而提高施氏鲟的消化能力。

4 结论

在本试验条件下，饲料中添加适量肌醇[（501.36～729.72）mg/kg]可促进施氏鲟肠道绒毛和皱襞的发育，提高施氏鲟蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，并能减少施氏鲟肝脏的空泡化现象，促进细胞核发育，进而改善肠道和肝脏健康。