王婷，牛蔓，张奕

在世界范围内，肺癌是病死率最高的肿瘤。2020年全球癌症数据显示，肺癌在全球185个国家共造成180万死亡病例，位居36种癌症之首［1］。按照病理类型，肺癌可分为小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），NSCLC又进一步分为腺癌（38.5%）、鳞癌（30.0%）、大细胞癌（2.9%）及其他［2］。因大多数肺癌患者就诊时处于疾病的中晚期，故含铂双药化疗成为治疗肺癌的主要手段。然而，即使接受标准化疗方案，中晚期肺癌患者预后仍较差，其中SCLC患者平均总生存期不足1年［3］。近些年，因突变位点被发现，部分肺腺癌患者预后得到极大改善，靶向药物也逐步在早期有位点突变肺癌患者的术后辅助治疗及晚期有位点突变肺癌患者一线治疗中被广泛使用［4］。积极探索肺癌发生及发展的分子机制也成为众多科研工作者的首要任务。

S100蛋白为小分子钙结合蛋白，家族中共包含25个成员，其中至少有16个成员基因位于易发生重排的1号染色体长臂2区1带（1q21）［5］。S100A6作为该家族中的重要一员，被证实与包括肺癌在内的多种肿瘤生物学功能相关［6］。本课题组前期研究发现，S100A6可抑制肺癌细胞株Calu-6增殖、侵袭和迁移，在裸鼠肺癌模型中可促进细胞凋亡，在细胞水平上有抑癌作用［7］。本研究进一步证实S100A6可抑制肿瘤的增殖，同时比较常见NSCLC标志物表达的差异，探讨S100A6对人肺癌细胞株Calu-6分化的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验时间 本实验时间为2021年6月至2022年2月。

1.2 实验材料

1.2.1 实验动物 8～10周龄BALB/c裸鼠15只，购于武汉优尔生生命科学装备有限公司。饲养条件为：室温26～28 ℃，相对湿度50%左右，保持通风，适当光照，所供饲料经灭菌处理。

1.2.2 实验细胞 肺癌细胞株Calu-6（人肺退行性肺癌可传代细胞系，未分化）购于中国科学院，293T细胞（人胚肾细胞）购于武汉优尔生生命科学装备有限公司，保存于CO2培养箱，2 h后开始实验。

1.2.3 实验试剂与仪器 DMEM培养基（赛默飞世尔科技有限公司，货号：121000061），MTT检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号：M1020），细胞周期检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号：CA1510），细胞凋亡检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号：CA1040），T25细胞培养板（广州硕谱生物科技有限公司，货号：T25-011-050），6孔细胞培养板（广州硕谱生物科技有限公司，货号：T25-010-006），CO2培养箱（赛默飞世尔科技有限公司），CX33显微镜〔奥林巴斯（中国）有限公司〕。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养及pLVX-AcGFP1-N1-S100A6的构建 将肺癌细胞株Calu-6保存于37 ℃、5% CO2条件下，于高糖DMEM培养基（含15%热灭活胎牛血清、100 U/ml链霉素、100 U/ml青霉素）中培养扩增。2周后，采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）制备PLVX-AcGFP1-N1-S100A6，引物信息为：正向引物5'-CCCAAGCTTA CCATGGCATGCCCCCTGGTCA-3'，反向引物5'-C GGAATTCCGGTCAGCCCTTGAGGGCTTCATT-3'。PCR的具体步骤和条件为：孵育（95 ℃、5 min）、变性（94 ℃、30 s，共44周）、退火（55 ℃、30 s）、延伸（72 ℃、30 s）。

1.3.2 病毒载体构建 以2∶1∶1的比例将pLVXAcGFP1-N1-S100A6、pMD2.G和psPAX2共同转染293T细胞，构建S100A6过表达慢病毒；以2∶1∶1的比例将pLVX-AcGFP1-N1、pMD2.G和psPAX2共同转染293T细胞，构建空载体慢病毒。

1.4 动物模型制备 BALB/c裸鼠采用简单随机法分为S100A6实验组7只、空载体组4只、空白对照组4只，将S100A6过表达慢病毒、空载体慢病毒及空细胞分别注射到S100A6实验组、空载体组、空白对照组BALB/c裸鼠右前背部。第2周开始每周测量BALB/c裸鼠的肿瘤体积，5周后处死裸鼠，取出肿瘤组织。

1.5 免疫组化印记法检测经典NSCLC标志物 采用免疫组化印记法检测5个经典NSCLC标志物在肿瘤组织中的表达情况，包括腺癌标志物〔甲状腺转移因子（thyroid transcription factor，TTF）-1、天冬氨酸蛋白酶A（NapsinA）〕及鳞癌标志物（P40、CK5/6、P63）。具体过程：使用3%过氧化氢去除肿瘤组织内源性过氧化物酶活性，后使用标志物一抗（TTF-1兔单抗，Abcam ab76013；NapsinA兔单抗，Abcam ab248340；P40兔单抗，Abcam ab76158；CK5/6鼠单抗，Abcam ab17133；P63兔单抗，Abcam ab124762）孵育，250倍稀释，4 ℃过夜。加入辣根过氧化物酶标记的二抗（室温，30 min）后使用二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）处理、苏木素染色。使用200倍显微镜随机选择10个视野观察上述标志物表达情况。表达程度评分标准为：25%细胞表达阳性为1分，26%～50%细胞表达阳性为2分，51%～75%细胞表达阳性为3分，＞75%细胞表达阳性为4分。强度评分标准为：无染色为0分，弱染色为1分，中等程度染色为2分，强染色为3分。表达程度评分加强度评分为最终评分结果，根据最终评分结果，判定＜4分为阴性，≥4分为阳性。

1.6 统计学方法 采用SPSS 26.0统计学软件进行数据分析。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肿瘤体积 第2、3、4、5周三组裸鼠肿瘤体积比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中S100A6实验组裸鼠肿瘤体积小于空载体组和空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 三组裸鼠肿瘤体积比较（±s，mm3）Table 1 Comparison of tumor volume in three groups of nude mice

表1 三组裸鼠肿瘤体积比较（±s，mm3）Table 1 Comparison of tumor volume in three groups of nude mice

注：a表示与空白对照组比较，P＜0.05；b表示与空载体组比较，P＜0.05

组别 只数 第2周 第3周 第4周 第5周空白对照组 4 13.1±4.4 31.7±3.9 153.8±16.9 332.5±53.0空载体组 4 12.4±0.8 32.9±1.9 147.4±17.5 318.2±53.3 S100A6实验组 7 1.4±1.4ab 7.0±3.5ab 54.2±8.6ab 107.4±14.2ab F值 9.12 19.55 20.52 14.01 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 经典NSCLC标志物 三组肿瘤组织中TTF-1、NapsinA、P40、CK5/6均表达阳性，S100A6实验组、空载体组、空白对照组肿瘤组织中P63表达阳性率分别为7/7、3/4、3/4，见图1。

图1 经典NSCLC标志物在三组肿瘤组织中的表达（苏木素染色，×200）Figure 1 Expression of classic NSCLC markers in three groups of tumor tissues

3 讨论

本课题组前期研究成功构建了S100A6过表达肺癌细胞株Calu-6系，通过比较Calu-6、Calu-6/neo、Calu-6/S100A6细胞生物学行为证实，S100A6可抑制肺癌细胞株Calu-6增殖、侵袭和迁移，将细胞注射裸鼠体内后，S100A6实验组裸鼠肿瘤体积明显小于其他两组［7］。本研究在前期研究的基础上，采用免疫组化印迹法进一步分析三组肿瘤组织中经典NSCLC标志物的表达。免疫组化印迹法是恶性肿瘤病理诊断极其重要的辅助手段，其中辅助诊断肺癌的标志物已被纳入中国临床肿瘤学会肺癌诊疗指南［8］。常用的腺癌标志物包括TTF-1、NapsinA，鳞癌标志物包括P40、CK5/6和P63，而SCLC标志物包括CD56、Syn、CgA、TTF-1、CK、Ki-67。本研究纳入指南推荐的NSCLC标志物［9］，证实三组肿瘤组织中TTF-1、NapsinA、P40、CK5/6均表达阳性，S100A6实验组、空载体组、空白对照组肿瘤组织中P63表达阳性率分别为7/7、3/4、3/4，提示S100A6对未分化型肺癌细胞株Calu-6的分化方向（向鳞癌或腺癌方向）可能无明显影响。

S100蛋白家族与包括肺癌在内多种恶性肿瘤的发生、发展有关。S100A2被证实在进展期NSCLC患者的血清、组织中表达升高，其有促进肿瘤生长的功能［10］。S100A4高表达与NSCLC细胞株的低分化和病程进展有关［11］。作为S100蛋白家族中的一个重要成员，S100A6（Calcylin蛋白）第一个被证实与肿瘤细胞的分化程度有关，同时，该蛋白还被证实与肿瘤细胞侵袭和迁移能力有关［12］。研究发现，S100A6与骨肉瘤和结肠癌肿瘤高侵袭性相关［12］。在急性白血病和肝癌中，S100A6也呈高表达［13］。在NSCLC细胞系A549、NSCLC患者血浆及胸腔积液中，S100A6表达升高［14］。研究显示，S100A6可能在不同病理类型肺癌中存在差异表达：与纯细支气管肺泡癌组织（bronchioloalveolar carcinoma，BAC）相比，其他类型肺腺癌+BAC混合组织中S100A6表达升高［15］。ISHII等［16］使用免疫组化法分析了92例肺腺癌患者肿瘤组织中S100A6表达情况，结果证实与癌旁组织相比，S100A6在所有腺癌组织中表达升高，而这种表达升高趋势在含有BAC成分的肺腺癌组织中更明显。另一项关于S100A6在177例肺鳞癌患者组织中表达情况的分析发现，S100A6在肺鳞癌组织中存在差异表达，即在部分肺鳞癌组织中存在高表达，而在部分肺鳞癌组织中无高表达，且S100A6表达升高提示患者预后不佳［17］。本研究结果提示，S100A6可起到抑癌作用，而此结论与先前学者在A549中的结论相反［18］。推测S100A6矛盾研究结论的出现与研究选择的细胞株不同有关，即本研究选用的是未分化人肺癌细胞株，而后者选用的是腺癌细胞株。目前，尚未见S100A6对肺癌细胞株分化方向影响的研究报道，在骨肉瘤中，过表达S100A6被证实可抑制间充质干细胞向成骨细胞方向分化，从而促进肿瘤发生［19］。

综上所述，S100A6可抑制人肺癌细胞株Calu-6增殖，但对未分化型肺癌细胞株的分化可能无明显影响。虽然本研究未出现阳性数据，但本研究首次探讨了S100A6对肺癌细胞株分化的影响，仍期待后续研究纳入多种细胞株进一步探索S100A6对肺癌细胞株分化方向的影响。

作者贡献：王婷进行文章的构思与设计，论文撰写；牛蔓进行研究的实施与可行性分析，资料收集、整理；张奕进行统计学处理、论文的修订，负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责、监督管理。

本文无利益冲突。