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软枣猕猴桃UPLC指纹图谱研究

2022-08-25赵天宇李星辰王法宇李庆杰

人参研究 2022年4期
关键词:软枣果酸乙腈

赵天宇,李星辰,王法宇,何 蕊,李庆杰*

(1.长春中医药大学,长春 130117;2.长春工业大学,长春 130012;3.北京医药集团职工大学,北京 100079)

软枣猕猴桃(Actinidia arguta)为猕猴桃科猕猴桃属(Actinidia)的大型落叶藤本植物,生于混交林或水分充足的杂木林中,在东北地区俗称软枣子[1]。我国境内分布广泛,中国从最北的黑龙江岸至南方广西境内的五岭山地都有分布。软枣猕猴桃果实味道鲜美,富含维生素C,广泛用于生食、酿酒、加工蜜饯果脯等,其天然产量大、经济意义重大,并且有悠久的应用历史[2]。其果实营养成分丰富,具有一定的营养与保健功能。迄今对软枣猕猴桃栽培与产品加工、化学成分与生物活性研究的有关文献较多,但特征指纹图谱的研究未见报道,为了更全面控制软枣猕猴桃质量,本研究参考相关文献,采用UPLC法建立了软枣猕猴桃的特征指纹图谱分析方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1290超高效液相色谱仪,含G1329A自动进样器、G4212B DAD检测器(美国,Agilent公司);JM-B2102型电子天平(余姚市纪铭称重校验设备有限公司);FA1605型电子天平(上海横平仪表厂);KH-100B型超声波清洗器(昆山和创超声仪器有限公司)。SVEA A132V1 C18色谱柱(50mm×2.1mm,1.7μm)。

1.2 试药

熊果酸对照品(批号:110742-201622),购自中国食品药品检定研究院;乙腈为色谱纯;水为自制纯水;其他试剂均为国产分析纯。

收集不同产地的软枣猕猴桃13批,将各产地编号为S1~S13,其中,S1(批号:200901)、S2(批号:200902)产地为安图县二道白河镇;S3(批号:200903)、S4(批号:200904)产地为蛟河市;S5(批号:200905)、S6(批号:200906)、S7(批号:200907)产地为和龙市;S8(批号:200908)、S9(批号:200909)、S10(批号:200910)产地为吉林市;S11(批号:200911)、S12(批号:200912)、S13(批号:200913)产地为靖宇县。经吉林省中医药科学院南敏伦教授鉴定为猕猴桃科植物软枣称猴桃Actinidia arguta(Sieb.&Zucc)Planch.ex Miq的果实。

2 方法与结果

2.1 HPLC色谱条件

色谱柱:SVEA A132V1 C18色谱柱(50mm×2.1mm,1.7μm);流动相:乙腈(A)-水(B)梯度洗脱:0~2min,3%A;2~4min,3%~5%A;4~6 min,5%~8%A;6~8 min,8%~15%A;8~10 min,15%~25%A;10~15 min,25%~90%A;15~18 min,90%~95%A;18~20 min,95%~3%A;20~30 min,3%A;流速:0.3ml/min;检测波长210nm;进样量5μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备

取适量熊果酸对照品,精密称定5.23mg,置于5ml量瓶中,加入甲醇振摇使溶解,后加甲醇定容至刻度,制成每1ml含有熊果酸1.046mg的溶液,即得对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备

取样品粉末5.0g,精密称定,置于250ml索氏提取器中,加甲醇加热回流提取5h,冷却,摇匀,滤过,水浴浓缩,定容至2ml,微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验[3,4]

取S1号供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件进样6次,记录色谱图,将图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价体系》(2012版),计算相似度,相似度均为1.000。选用熊果酸色谱峰为参照峰,计算其他共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值,共有峰相对峰面积RSD≤1.2%,相对保留时间RSD≤0.5%,表明仪器精密度良好,符合检测需求。

2.3.2 稳定性试验

取软枣猕猴桃(S1)样品溶液,按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,分别在0、2、4、8、12、24 h进样,按“2.1”项下色谱条件记录色谱图。将其导入《中药色谱指纹图谱相似度评价体系》(2012版),得到各个样品的相似度,结果显示相似度均大于0.999。以熊果酸峰为参照峰,分别计算共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值。结果表明,共有峰相对保留时间及相对峰面积RSD均≤2.0%,表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.3.3 重复性试验

精密称取S1号样品6份,按“2.2.2”项下方法制备供试液,按“2.1”项下方法检测,记录色谱图,将图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价体系》(2012版),得到各个样品的相似度,结果显示均大于0.999。以熊果酸峰为参照峰,计算各共有峰相对峰面积、相对 保留时间的RSD,均小于2.0%,表明方法重复性良好。

2.4 软枣猕猴桃UPLC指纹图谱的建立[5,6]

取13批软枣猕猴桃,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,另取“2.2.1”项下对照 品溶液,按“2.1”项下色谱条件分别进样,记录UPLC色谱图。样品的色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价 系统》(2012版)软件进行分析,选择峰面积较大且分离度较好的S1号样品图谱作为参照图谱,进行多点校正,色谱峰全峰自动匹配,以中位数法(时间窗宽度为0.1)生成软枣猕猴桃对照特征图谱。软枣猕猴桃UPLC的对照品图谱及13批软枣猕猴桃样品特征图谱的匹配图分别见图1、2。熊果酸的出峰时间居中,峰面积较大,分离度较好,因此选取该峰作为参照峰(S),计算13批软枣猕猴桃样品各共有峰的相对保留时间,RSD均≤0.32%,表明所得软枣猕猴桃指纹图谱可信度较高。

2.5 指纹图谱相似度评价

将各个批次的软枣猕猴桃指纹图谱分别导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)软件,对各批次样品的指纹图谱与对照图谱进行相似度评价。从图1可以看出13批软枣猕猴桃的整体图貌基本一致。13个产地的软枣猕猴桃的相似度达到了0.887,有较好的相似性,详见表1。

表1 样本相似度评价

图1 对照品熊果酸的色谱图

图2 13批次软枣猕猴桃提取物的指纹图谱

2.6 软枣猕猴桃中熊果酸含量

以熊果酸对照品为指标,用UPLC测定13批软枣猕猴桃中熊果酸的含量,其平均含量为0.0864mg/g,13批样品含量RSD值为2.77%,详见表2。

表2 13批软枣猕猴桃中熊果酸含量测定

3 讨论

3.1 波长选择

考察210、230、280、254、320 nm波长下的各色谱峰,210 nm波长检测到的色谱峰信息较全面,且各色谱峰的峰形及分离度较好,因此最终选择210 nm作为软枣猕猴桃UPLC指纹图谱的检测波长。

3.2 流动相选择

尝试选择乙腈-水、甲醇-水2种流动相进行UPLC梯度洗脱分析,结果显示,甲醇-水所得色谱峰较多,但部分峰的峰形、分离度较差,乙腈-水所得峰形、主要成分分离度较好,故选择乙腈-水作为软枣猕猴桃UPLC分析测定的流动相。

3.3 采集的13个不同批次的软枣猕猴桃虽有差异,但相似度均≥0.88,可作为软枣猕猴桃的质量控制方法。以熊果酸含量为指标,测定13批样品中熊果酸的平均含量为0.0864mg/g,RSD值小于3%。

综上所述,本文采用UPLC特征指纹图谱分析方法初步建立了满药软枣猕猴桃质量评价标准,对有关机构进一步研究开发满药软枣猕猴桃有一定参考作用。

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