刘春显，李 南

（集安市北纬四十一度参业有限公司·吉林通化·134211）

皮肤的衰老是一个不可逆且复杂的过程，受多种内外因素调控。目前人们一直致力于研究皮肤的衰老机制。其中，氧化应激被认为是细胞衰老的一个重要因素[1-3]；细胞在代谢的过程中会产生具有强氧化能力的自由基，其可以攻击生物膜系统，导致细胞死亡，最终引起病变或衰老[4-6]。因此，抗氧化成为防御衰老的一个热门作用靶点，而抗氧化天然药物的筛查也成为了近年来的热点问题。

人参具有抗氧化，抗炎症，抗疲劳，调节血压等功效，其在中药中的应用已有数千年的历史[7-10]。人参皂苷是人参中的有效成分，是一种甾体皂苷，主要来源于人参的根部[11]。人参皂苷Rb1是人参皂苷中最常见、含量较为丰富的一种亚型，其在不同组织中的抗氧化作用也得到了较为广泛的报道，但尚未有皮肤相关的研究开展。本研究围绕人参皂苷Rb1抗氧化作用在皮肤领域的应用研究，在体外实验中证实了人参皂苷Rb1可以预防抵抗过氧化氢诱导的HSF细胞氧化衰老，并探究了人参皂苷Rb1对细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系

本实验所用的人体真皮成纤维细胞系（HSF细胞系）购自武汉普诺赛生命科技有限公司（货号CPH103）。

1.1.2 主要试剂

人参皂苷Rb1购于MCE公司（货号HYN0039）；人体真皮成纤维细胞完全培养基购于武汉普诺赛生命科技有限公司（货号CM-H103）；CCK8试剂盒购自Biosharp公司（货号BS350A）；ROS检测试剂盒购自碧云天公司（货号S0033S）；抗Cleaved Caspase-3抗体购自CST公司（货号9664S）；山羊抗兔IgG 594购自中杉金桥公司（货号ZF-0516）。

1.1.3 主要仪器设备

细胞培养箱（Thermo）；超净工作台（Airtech）；倒置荧光显微镜（Nikon）；酶标仪（Tecan）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与传代

HSF细胞培养于人体真皮成纤维细胞完全培养基中，条件为37℃，5%CO2，传代时，先使用移液器吸去旧培养基，随后使用无菌PBS清洗2次，再加入适量的0.25%的胰酶，37℃孵育1分钟后终止消化，将皿底/瓶底的细胞吹打下来，取适量细胞传代至其他培养皿/培养板中。

1.2.2 CCK8细胞活力检测

将5×103个细胞传代至96孔板中培养一段时间后进行加药处理（筛选过氧化氢浓度时，使用200、400、600、800、1000μM浓度的过氧化氢处理细胞3小时；筛选人参皂苷Rb1浓度时，先使用0～1000μM等9个浓度的人参皂苷Rb1预处理细胞2小时，随后再使用600μM过氧化氢处理细胞3小时），处理结束后，为避免培养基中所含物质对下游实验的影响，将96孔板中的培养基替换为100μl新的培养基，随后每孔加入5μl CCK8溶液，将培养板放回CO2培养箱中继续培养20分钟后，使用酶标仪450nm吸光值进行波长测定，并计算细胞活力。

1.2.3 DCFH-DA活性氧检测

将适量细胞传代至共聚焦皿中进行培养，待细胞生长至对数期进行实验，加药处理过后，弃掉培养基；使用无血清培养基以1∶1000的比例稀释DCFH-DA探针，并将适量稀释后的探针加入到共聚焦皿中，加

入量以盖住所有细胞面积为宜，随后将细胞置于CO2培养箱中继续孵育30分钟，完成后使用无血清培养基洗涤3次，随后直接使用荧光显微镜进行观察与图片拍摄。

1.2.4 Caspase-3免疫荧光染色

使用4%多聚甲醛溶液固定加药处理后的细胞（处理方法见1.2.1）15分钟，随后使用PBS洗涤3次；然后使用0.02%TritonX-100溶液透化细胞15分钟并使用PBS洗涤3次，使用10%山羊血清溶液于室温下封闭细胞1小时，4℃过夜孵育一抗（Caspase-3稀释比例为1∶400，使用PBS稀释）。第二天，将细胞从4℃冰箱取出，室温下复温30分钟后，使用PBS洗涤3次，随后于避光室温下孵育荧光二抗1小时（二抗稀释比例为1∶400，使用PBS稀释），孵育后，使用PBS清洗3次后封片，并在荧光显微镜下进行观察并拍摄图像。

1.3 统计学处理

采用Graphpad Prism7软件进行数据分析与作图。数据以表示，采用双尾t检验比较数据间差异，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

2 结果

2.1 不同处理下的HSF细胞活力测定

2.1.1 不同浓度过氧化氢对HSF细胞的影响

由于皮肤衰老时伴随着细胞氧化应激的出现，因此细胞氧化应激模型成为研究皮肤衰老的常用模型之一。我们采用过氧化氢处理HSF细胞，从而构建HSF细胞氧化衰老模型。我们使用了不同浓度的过氧化氢处理HSF细胞，结果显示，较低浓度的过氧化氢（200μM与400μM）处理细胞时并未对细胞造成明显影响，而当浓度提升至600μM，处理3小时后，细胞形态明显改变并出现大量死亡现象，差异有统计学意义（图1与图3A,B）,随着浓度的增大，细胞死亡过于严重无法进行后续相关实验，因此我们选择浓度600μM过氧化氢作为构建模型的最佳浓度，并进行下一步的研究。

图1：过氧化氢诱导的HSF细胞衰老模型的建立

2.1.2 不同浓度的人参皂苷Rb1对过氧化氢毒性的拯救作用

在确立了过氧化氢的毒性后，我们进一步探究人参皂苷Rb1是否可以拯救HSF细胞氧化衰老模型。我们使用不同浓度的人参皂苷Rb1预处理细胞2小时后，再使用600μM过氧化氢继续处理细胞。结果显示，人参皂苷Rb1浓度提升至250μM时对过氧化氢所带来的氧化毒性有一定的缓解作用，而500μM的人参皂苷Rb1便可显著抵抗过氧化氢的毒性（图2与图3C）。这提示人参皂苷Rb1具有一定的抗氧化作用，从而可以抵御过氧化氢对细胞的影响。

图2：人参皂苷Rb1抗氧化作用的探究

图3：不同处理条件下的细胞形态

2.2 人参皂苷Rb1可以降低细胞内ROS水平

为了进一步验证人参皂苷Rb1的抗氧化性，我们分别检测了对照组，过氧化氢处理组与过氧化氢和人参皂苷Rb1共处理组细胞内ROS的水平。荧光探针DCFH-DA本身不自带任何荧光，当其穿过细胞膜进入细胞质时，可以被酯酶水解生成DCFH,而细胞内的ROS可以将DCFH氧化为带有荧光的DCF，因此细胞内荧光的强弱即可反映细胞内ROS的含量。由于600μM过氧化氢处理细胞3小时导致细胞有较多死亡，不利于观察，因此我们选择缩短处理时间，检测细胞中ROS变化。结果显示，当使用600μM过氧化氢处理2小时后，细胞内的ROS含量急剧上升，而500μM人参皂苷Rb1预处理2小时可以降低由过氧化氢造成的ROS过量生成（图4），从而避免细胞氧化应激的出现，这为人参皂苷Rb1的抗氧化作用提供了直接证据。

图4：不同处理条件下的细胞ROS含量测定

2.3 人参皂苷Rb1可以抑制过氧化氢诱导的细胞凋亡

最后，为了探索人参皂苷Rb1影响细胞存活的机制，我们使用抗Cleaved Caspase-3抗体进行免疫荧光染色观察细胞凋亡情况。结果显示过氧化氢处理2h导致细胞核中的Caspase-3表达明显上调，即诱导了细胞凋亡的发生，而人参皂苷Rb1预处理后可显著抑制凋亡的发生，结果证实了人参皂苷Rb1具有明显的抗细胞凋亡的作用（图5），保护细胞使其继续存活。

图5：不同处理条件下的细胞凋亡检测

3 讨论

皮肤衰老是一个复杂的过程，其伴随着含水量降低，新陈代谢减慢，免疫力下降等多个过程。皮肤衰老的特征是失去弹性、松弛、出现皱纹和粗糙的外观等[12]。这一老化过程伴随着皮肤细胞的表型改变以及细胞外基质成分如胶原蛋白和弹性蛋白的结构和功能改变以及炎症的增多等[13],[14]。皮肤是人体最大的器官，是隔离身体与外界的屏障，防止人体水分的流失以及微生物的感染；皮肤衰老不仅会影响人的外貌仪表，其健康屏障的生理功能也会因此受损，致使免疫力降低进而引发疾病等[15]，因此，抵御或逆转皮肤衰老不仅是改善外在容貌的问题，又是一个意义深远但又十分艰巨的健康维持问题。在关于皮肤衰老机制的探索研究中，ROS过量产生导致细胞氧化还原失衡是皮肤衰老的主要因素之一[16-18]。ROS是机体内或者自然环境中由氧组成，含氧并且性质活泼的物质的总称。一般来说，细胞内部的线粒体电子呼吸链、过氧化物酶体与内质网定位蛋白在行使生理功能时会产生大量ROS[19]；而皮肤作为人体与外界直接接触的器官，又会受到一些外部因素的影响，例如紫外线的照射会加剧ROS的过量生成，造成皮肤“光老化”[20-22]。这些内外因素共同作用生成的ROS会攻击细胞的生物膜系统，诱导脂质过氧化，并且ROS可以激活MAPK途径，随后增加MMP的产生，从而降解胶原，最终导致皮肤的衰老[23],[24]，因此抗氧化，即使用还原剂中和过量生成的ROS是抵抗皮肤衰老的常用策略。

但值得令人注意的是，一些研究人员认为，抗氧化剂的过量补充可能有害，并产生不良副作用。特别是在营养良好的人群中，抗氧化剂的最佳来源应该源自饮食，或者一些中药等天然的抗氧化物质，而不是专用的抗氧化补充剂等药物。抗氧化治疗的目的是恢复氧稳态，把活性氧水平降低到健康细胞的水平，而不是完全将其消除，抗氧化治疗才会对衰老(包括皮肤衰老)有帮助[25,26]。人参皂苷Rb1是野山参、西洋参等所含含量较高、功能较强的人参皂苷之一，在目前的研究中，人参皂苷Rb1被证实具有多种功效，例如抗氧化、神经保护、抗炎症等，但尚未有关于人参皂苷Rb1抗皮肤氧化的研究报道。值得注意的是，一项研究通过小鼠模型证明了人参皂苷Rb1在缓解修复烧伤皮肤以及抵御紫外诱导慢性皮肤光老化的重要作用[27]，这更加证实了人参皂苷Rb1在皮肤领域具有较大的应用潜力。

在本研究中，我们旨在探究天然化合物人参皂苷Rb1是否具有作为抵抗皮肤衰老还原剂的潜能。使用过氧化氢诱导产生氧化损伤的细胞是衰老研究的常用方法之一[28,29]，我们首先使用了不同浓度过氧化氢处理HSF细胞，发现当过氧化氢浓度达到500μM时，细胞出现明显死亡现象，因此我们采用该处理条件建立HSF细胞氧化衰老模型，随后我们发现500μM人参皂苷Rb1预处理细胞2小时可以显著缓解过氧化氢的细胞毒性，因此我们初步认为人参皂苷Rb1的抗氧化作用可以使HSF细胞免受过氧化氢的氧化毒性，为了验证我们的猜想，我们使用荧光探针检测了各组细胞中ROS的含量，发现人参皂苷Rb1预处理组的细胞中ROS含量的确明显低于未预处理组，因此我们得出结论，在HSF细胞中，人参皂苷Rb1通过抗氧化作用影响过氧化氢毒性，该结论为人参皂苷Rb1的抗氧化性在皮肤抗氧化防治中提供了坚实的证据，最后，我们通过免疫荧光染色证实了人参皂苷Rb1的抗凋亡作用。综上所述，本研究通过体外实验证明了人参皂苷Rb1的抗氧化作用，揭示了其在皮肤衰老干预的应用前景，为后续相关人参产品的开发应用提供了理论基础。