王 乐,柳成林,韩文静,李旭辰,侯丽慧,陈 欣,于秀华*

（1.长春中医药大学，长春 130117；2.第964医院，长春 130021；3.长春中医药大学附属医院，长春 130021）

补肾活血颗粒是一种复方制剂，由丹参、赤芍等中药组成,以各味药材的理化性质和药理作用为研究基础，同时考虑到临床要求及生产制备的可行性等因素，对其工艺路线进行优化设计。经查阅资料显示，制成颗粒剂能最大限度保持原方功效。中药颗粒剂制备工艺简单，生产成本低，携带方便[1]，为了更好发挥药物性能,同时便于患者服用，将其制成颗粒剂，根据对处方中中药化学成分及理化性质的分析，研究采用丹参、当归等醇提、剩余丹参、赤芍等水煎醇沉提取工艺技术条件，醇提以提取物中丹酚酮IIA、苍术素的含量为考察指标，采用多因素多水平设计的正交实验对条件进行优选。剩余丹参、赤芍等也采用正交方法选出最佳条件，以样品中丹酚酸B、芍药苷、阿魏酸的含量为考察指标，结合药物中有效成分的理化性质，选取水为提取溶剂，进行水煎提取工艺研究。本文将补肾活血颗粒工艺进行优化,既为该方开发成医疗机构制剂提供依据[2]，又为其药物性能开发和临床应用提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津，SPD检测器）；C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；AMW220D分析天平（日本岛津）；BSA224S电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；超声波清洗仪器（昆山合创超声仪器有限公司）。

1.2 试药

丹参酮ⅡA对照品（110805-200508）、苍术素对照品（111924-201605）、芍药苷对照品（110736-200934）、丹酚酸B对照品（120976-200503）、阿魏酸对照品（0773-9910）均购于中国食品药品生物检定研究院；甲醇、乙腈及其他试剂均为分析纯，纯水、超纯水（长春中医药大学附属医院实验中心）。

2 方法与结果

2.1 丹参酮ⅡA、苍术素的含量测定

2.1.1 色谱条件

2.1.2 对照品溶液的制备

取定量标准品置棕色量瓶中配置成以下浓度的混合溶液：丹参酮ⅡA(30μg/ml)、苍术素(70μg/ml)，即得。

2.1.3 供试品溶液的制备

按照正交试验表进行正交实验，将容量瓶内各药材醇提溶液摇匀，精密吸取5ml至锥形瓶，蒸干，加入用移液管精准称量的25ml甲醇，使用分析天平对其进行称重，放入超声波清洗器中超声30分钟，再次用分析天平称定，用胶头滴管缓慢滴加甲醇进行补重，使重量与之前称定重量一致，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 线性关系考察

取混合对照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、15.0、20μl，注入仪器，根据峰面积积分值和进样量绘出标准曲线，计算回归方程。

通常情况下，于朦胧习惯于做一个倾听者和安慰别人的人，朋友们也喜欢找他倾诉，安慰别人是不求回报的，但安慰别人安慰得多了，自然也会得到别人的安慰，这是一个双向的过程。《轩辕剑之汉之云》拍摄时，于朦胧从高处意外摔伤，腿部骨折，说起这段受伤经历，他第一时间的反应不是伤痛多么厉害，而是“我躺在病床上，也还是感受到世界深深的善意，身边的朋友和同事都来看我，当时就觉得很温暖”。

表1 丹参酮‖A、苍术素线性回归方程

2.1.5 精密度试验

取同一对照品溶液，精密吸取10μl，选择不同时间、于不同仪器、不同人员进行测定，记录图谱。丹参酮ⅡA RSD值0.08%、苍术素RSD为0.09%。RSD平均值都小于1%，试验结果表明：对照品溶液精密度较好。

2.2 芍药苷、丹酚酸B、阿魏酸的含量测定

2.2.1 色谱条件

采用C18（Apollo-C18，250mm×4.6mm）色谱柱；流动相为0.2%磷酸（B）-乙腈（A）梯度洗脱(0-10min,15%A;10-20min,15-33%A;30-35min,20%-40%A;33-22min,40%-44%A;40-50min,22%-15%A)，检测波长为286nm、230nm、320nm，流速为1.0ml/min。

2.2.2 对照品溶液的制备

取定量标准品，精密称定，配置成以下浓度的溶液：丹酚酸B(30μg/ml)、芍药苷（400μg/ml)、阿魏酸(5μg/ml)，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备

精密称定上述9份提取物粉末各0.3g，放于锥形瓶，加入30ml甲醇，称重，超声30分钟，再次称定，补重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 线性关系考察

取混合对照品溶液5.0、10.0、12.0、15.0、20.0、25.0μl，注入仪器，根据峰面积积分值和进样量计算回归方程，详见表2，结果表明，线性关系良好。

表2 线性关系考察结果

2.2.5 精密度试验

取同一对照品溶液，精密吸取10μl，于不同时间、不同仪器、不同人员进行测定，记录HPLC图谱。RSD值分别为芍药苷2.97%、丹酚酸B0.69%、阿魏酸0.22%。试验结果表明：精密度较好。

2.3 正交试验设计

2.3.1 醇提工艺考察

丹参（处方一半的量）、当归等药材，采用正交法优选最佳醇提条件：考察因素为乙醇浓度（A）、加醇量（B）、提取次数（C）、提取时间（D），每个因素选取三个水平，乙醇浓度分别为70%、80%、95%，加醇量分别为4、6、8倍，提取次数为1、2、3次，提取时间分别为1、1.5、2h，以丹酚酮IIA、苍术素含量为评估指标。按处方比例称取9份药材，按上述试验，提取液滤过后浓缩并定容于100ml量瓶,备用。按照上述三因素四水平生成正交表，计算结果。苍术素含量（mg/g生药）分 别 为4.3926、2.1624、5.9729、8.5341、9.0506、7.7666、7.2777、3.1846、4.6490，丹参酮ⅡA含量（mg/g生药）分别为0.4938、4.8049、7.5451、4.8536、6.3142、0.3847、1.7650、0.3137、0.5594。

以丹参酮ⅡA含量、苍术素含量作为指标的正交实验结果分析如下文所示，丹参酮ⅡA含量正交结果分析中A1＞A2＞A3，B2＞B3＞B1，C3＞C2＞C1，D3＞D2＞D1，苍术素含量正交结果分析中A2＞A1＞A3，B1＞B2＞B3，C3＞C2＞C1，D3＞D2＞D1。各因素影响顺序均为提取次数（C）＞乙醇浓度（A）＞提取时间（D）＞加醇量（B），方差分析结果可知乙醇浓度（A）、加醇量（B）、提取次数（C）、提取时间（D）的差异具有统计学意义（P＜0.05)，由此可以看出，对丹参酮ⅡA含量影响较大的是提取次数，其他因素对丹参酮ⅡA显著性差异影响很小，而对苍术素含量影响较大的是乙醇浓度，其次为提取次数。从实际的生产角度出发，拟定出最优工艺为A2B2C3D3，即6倍量80%乙醇提取3次，每次2个小时。

2.3.2 水提工艺考察

丹参（处方量的一半）、赤芍等药材，可有效去除叶绿素等极性小的成分，最大限度保留活性成分。用正交法优选：以加水量(A)、煎煮时间(B)、煎煮次数(C)、空白(D)为考察因素，每个因素选取三个水平，分别为加水量4倍、6倍、8倍，煎煮时间1、1.5、2小时，煎煮次数1、2、3次，考察样品中丹酚酸B、芍药苷、阿魏酸的含量以及出膏率。

按处方比例称取9份药材，每份65g。按表6实验，将水煎液滤过蒸干，减压干燥，取出，称重，粉碎，计算出膏率。得到出膏率分别为17.8、30.21、36.34、29.32、37.02、22.73、36.02、23.58、34.42，阿魏酸含量（mg/g生药）分别为0.24、0.2、0.21、0.36、0.17、0.29、0.16、0.12、0.37，芍药苷含量 （mg/g生药）分别为33.56、48.09、54.79、51.84、46.31、40.29、65.37、46.37、63.57，丹酚酸B含量（mg/g生药）分别为5.67、6.53、8.92、7.73、8.2、6.3、11.01、6.68、9.18。

以出膏率、芍药苷含量、丹酚酸B、阿魏酸含量作为指标的正交实验结果分析如下文所示，出膏率的正交结果分析中A3＞A2＞A1，B3＞B2＞B1，C3＞C2＞C1，芍药苷的正交结果分析中A3＞A2＞A1，B1＞B3＞B2，C3＞C2＞C1,丹酚酸B的正交结果分析中A3＞A2＞A1，B1＞B3＞B2，C3＞C2＞C1,阿魏酸的正交结果分析中A2＞A1=A3，B3＞B1＞B22，C2＞C1＞C3，出膏率的各因素影响顺序为：煎煮次数（C）＞煎煮时间（B）＞加水量(A），芍药苷、丹酚酸B的各因素影响顺序为：煎煮次数（C）＞加水量(A）＞煎煮时间（B）。方差分析结果可知加水量(A)、煎煮时间(B)、煎煮次数(C)之间的差异具有统计学意义（P＜0.05)，其他因素对提取时间及加水量对活性成分显著性差异影响很小。根据实验结果结合方差分析最终确定工艺为A3B1C2，即8倍量水提取2次，每次1个小时为最佳。

3 讨论

3.1 剂型的选择

在现代中药发展的进程中，中药颗粒剂在人类的生产生活中逐渐被广泛应用。其特色在于剂量相对较小且质量稳定，便于患者携带、服用[3]，颗粒剂将原中药经典方剂的药性、药效进行保留，且相对于汤剂相比较其优点在于不需要煎煮可直接冲开服用、量少且迅速在体内发挥药效[4]。传统汤剂煎煮耗费时间、程序繁琐、保质期短、对保存条件比较严格，颗粒剂恰好能够完善传统剂型中存在的缺点。中药配方颗粒剂大大满足了现代人们的生活需求，近些年来，中药配方颗粒在我国发展迅速，在临床中被广泛使用，逐渐替代了传统中药饮片[5]，在工业生产中也具有相当好的发展前景。与传统剂型比较，剂量精准药效吸收迅速，且作用相对较缓[6]，制剂过程中又可加入矫味剂改善口感，便于患者中年幼的孩童和年迈的老人服用，故选择采用颗粒剂剂型。颗粒剂不但提升了补肾活血颗粒处方中药的药物性能,剂型上来讲更有利于携带和服用,某种程度上来讲大大的为患者们提供了便利,同时也给补肾活血颗粒带来更广阔的发展前景。

3.2 工艺路线的确定

补肾活血颗粒的处方为中药复方制剂，由丹参、赤芍等中药所组成。丹参有活血化瘀的功效，丹参酮ⅡA是丹参中有效成分,药理作用范围广[7，8]，苍术素作为苍术的有效成分之一，其药理活性表现在抗炎、抗肿瘤、利尿等方面[9，10]，根据各味药材的理化性质和药理作用，首先将1/2丹参、当归、益母草、苍术、香附、石菖蒲、焦山楂，采用正交实验优选乙醇提取条件，提取物中最具有代表性的丹酚酮IIA、苍术素进行考察。

丹酚酸B为水溶性成分，在丹参中含量最多[11，12，13]。阿魏酸易溶于水是川芎酚酸类活性成分的代表性物质[14]，是一种功能性酚酸存在于植物细胞壁中[15]。芍药苷是赤芍的主要成分，是一种水溶性单萜类糖苷[16，17]，其药理作用于为抗炎，神经系统等方面。根据各药物理化性质，对样品中丹酚酸B、芍药苷、阿魏酸含量进行分析。设计工艺流程将1/2丹参、赤芍、牛膝、茯苓、续断、熟地、柏子仁、泽兰采用水煎醇沉工艺，有效去除叶绿素等极性小的成分，最大限度保留药物的活性成分。

3.3 提取工艺技术条件的研究

药品的质量和疗效与药物有效活性物质的提取息息相关。药物的有效成分提出的溶解度高，药品的质量会得到提升，药效也会更好。考虑到处方中各药材的理化性质，药理作用，研究将丹参、当归等醇提、剩余丹参、赤芍等水煎醇沉提取工艺技术条件进行考察，通过醇提取法和水煎煮法提取补肾活血颗粒处方中有效活性物质，通过正交试验选取最优工艺，结果显示，醇提的最佳工艺为6倍量80%乙醇提3次，每次2h。水煎煮的最佳工艺为8倍水提2次，每次1h。该方法简单可行，所得颗粒质量稳定。在该条件下，药材可以被利用更加完全，得到的药物有效成分提取率达到最高，可以更大程度的发挥药物的疗效。本研究不但使补肾活血颗粒更好满足中医临床用药需求，也为其在工业生产中开创了良好的应用。