阚鹏，顾家烨，芮敏，惠宇坚，沈建国

（东南大学附属江阴医院 骨科，江苏 无锡 214400）

创伤、烧伤、癌性溃疡、糖尿病足等各种原因导致的软组织缺损创面是一类常见病，容易造成脓毒症、截肢等严重后果，给患者带来巨大的心理和经济负担［1］。皮肤移植是修复此类创面的常用方法，但存在缺少供区、造成新损伤和操作复杂等缺点［2］。近年来，促进软组织重建的生物材料获得临床应用。这些材料通过特定的空间结构、生物信号和生物力学刺激引导组织重建，可避免组织移植或减少自体组织的用量［3］。一些研究显示，脱细胞基质能显著促进组织原位重建［4］，但存在制备工艺难以控制、疾病传播、核酸残留等缺点。而合成支架材料因原料性质稳定、制备工艺易于控制等优点能有效避免上述不足。临床现有的合成支架材料如胶原蛋白支架能为修复细胞提供三维生长空间，但由于缺乏对修复细胞的趋化活性以及诱导细胞迁移的功能，合成支架材料促进组织重建的速度缓慢，在严重软组织缺损创面如肌腱外露创面修复中的应用受到限制［5］。临床联合应用负压封闭引流系统和胶原蛋白支架，以促进修复细胞长入支架，从而加速组织新生。因此，具有对修复细胞的趋化活性和诱导细胞迁移的合成支架材料成为国内外研究的热点。

本研究的目的是构建体外培养骨髓间充质干细胞来源细胞外基质（bone-marrow mesenchymal stem cell-derived ECM,BM-ECM）和Ⅰ型胶原蛋白的复合支架（BM-ECM/胶原蛋白支架），通过引入BM-ECM，赋予胶原蛋白支架对修复细胞的趋化活性，以及促进细胞迁移和长入支架内部的功能。通过扫描电子显微镜观察材料的微观结构，并测试了材料的傅里叶红外吸收光谱。在体外实验中，通过Transwell 迁移实验检测在BM-ECM/胶原蛋白支架影响下成纤维细胞的过膜率，并检测了在BM-ECM/胶原蛋白支架作用下成纤维细胞划痕伤口愈合率。在体内实验中，通过小鼠皮下埋植模型，检测了长入BM-ECM/胶原蛋白支架的细胞密度并观察了细胞在支架中的分布情况，并通过免疫组织化学观察了成纤维细胞在支架中的分布。本研究构建了一种对修复细胞具有趋化活性并增强细胞迁移的复合支架，为软组织缺损修复提供新材料，也为新型软组织缺损创面修复材料的设计提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原代细胞取自6 周龄雄性C57BL/6J 小鼠，6只，体重（18.2±0.9）g。动物实验中使用的小鼠为6 周龄雄性C57BL/6J 小鼠，12 只，体重（18.5±1.4）g。所有动物均购自常州卡文斯实验动物有限公司。原代细胞培养实验和动物实验均遵循东南大学附属江阴医院和国家有关实验动物管理和使用的规定。BCA 蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物）；鼠尾Ⅰ型胶原蛋白、2 500 u/mg 胃蛋白酶（上海Sigma-Aldrich 公司）；苏木精-伊红染色试剂盒、抗ER-TR7 抗体［艾博抗（上海）贸易有限公司］；其他试剂均由国药集团和赛默飞中国有限公司提供。

1.2 仪器与设备

SU-1510 型扫描电子显微镜（日本株式会社日立高新技术那珂事业所）；CX23 生物显微镜（日本奥林巴斯公司）；Ti2 激光共聚焦显微镜［尼康仪器（上海）有限公司］。

1.3 试验方法

1.3.1 支架的制备 按文献［6］所述方法分离和培养6 周龄C57BL/6J 小鼠骨髓间充质干细胞，待传至第4 代时，将生长至100% 融合的细胞在含有50 mmol/L 抗坏血酸的DMEM 培养基中继续培养2 周，PBS 润洗，加入含20 mmol/L 氢氧化铵的1% 曲拉通PBS 溶液，常温孵育5 min 将细胞裂解；用细胞铲刮离培养物，然后用100 IU/mL 的DNase Ⅰ常温处理1 h，以除去培养物中的DNA；30 000 g 离心20 min，获得BM-ECM，并用生理盐水润洗和离心，重复3 次；用含0.1%胃蛋白酶的0.01 mol/L 盐酸溶液（3 mL/75 cm2培养瓶）常温下消化BM-ECM，过夜；加入333 μL 的10×PBS 溶液中和消化液，并用PBS 进行透析（截留分子量15 kD），获得BM-ECM 溶液，采用Pierce BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定终溶液的蛋白水平为（0.29±0.04）mg/mL。BM-ECM/胶原蛋白支架的制备：取含0.5%I 型胶原蛋的乙酸溶液8 mL，加入2 mL 上述BM-ECM 溶液，用匀浆机在冰浴条件下混匀，离心除去气泡；将所得溶液按500 μL/孔加入24 孔细胞培养板中，放置在-80℃冰箱冷冻凝固；冷冻干燥后，在饱和戊二醛蒸汽环境中放置15 min 后取出，放于常温真空干燥箱中1 h，除去多余的戊二醛分子，得到交联的BM-ECM/胶原蛋白支架；用生理盐水代替BM-ECM 溶液且不改变其他支架制备过程和条件，获得胶原蛋白支架。

1.3.2 FT-IR 和SEM 采用NicoletiS10 衰减全反射傅里叶变换红外光谱仪测试BM-ECM/胶原蛋白支架和单纯胶原蛋白支架的红外吸收光谱，检测范围4 000～500 cm-1，温度为室温，分辨率为4 cm-1。将支架裁成5 mm×5 mm×2 mm 的正方体，用导电胶粘贴在扫描电子显微镜台上，支架内部切片朝上，经干燥和喷金处理后，观察支架内部微观形貌。

1.3.3 支架皮下埋植动物实验 将12 只6 周龄雄性C57BL/6J 小鼠适应性饲养1 周，行异氟烷吸入性麻醉，用脱毛膏脱除小鼠背部毛发，用乙醇和碘伏消毒手术区域，在消毒区域中线两侧各制作长度5 mm 的纵向切口，切口距离大于1 cm；用组织剪撑开切口肉膜和筋膜，将直径为5 mm、厚度为1.5 mm 的BM-ECM/胶原蛋白支架和单纯胶原蛋白支架植入肉膜和筋膜之间的口袋，左侧植入BM-ECM/胶原蛋白支架，右侧植入单纯胶原蛋白支架，缝合切口，消毒。术后5 d、10 d，随机取6 只小鼠，经二氧化碳安乐死后，切取埋植支架及相邻皮肤组织，用40 g/L 多聚甲醛固定12 h，一半进行冰冻切片，切片厚度5 μm，剩余一半进行脱水、石蜡包埋和切片，切片厚度为4 μm。石蜡切片按生产厂家说明书行苏木精-伊红染色；冰冻切片行抗ER-TR7 免疫化学染色，行ER-TR7 抗体（1∶100）和山羊抗兔Alexa Fluor 647 标记二抗（1∶200）孵育，并用DAPI 复染。采用正置显微镜观察苏木精-伊红染色切片，激光共聚焦显微镜观察ER-TR7 染色切片。使用Image J 软件进行图像处理和细胞计数，选取H&E 图像中距离支架上缘约0.1 mm、边长为0.1 mm 的正方形区域，计数细胞数量并计算细胞密度。。

1.3.4 纤维细胞趋化和划痕愈合体外实验 将第3 代人真皮成纤维细胞（Sigma-Aldrich，美国）复苏12 h 后，用含1%牛血清白蛋白的DMEM 培养基饥饿细胞12 h，胰酶消化，用含10%牛血清白蛋白的DMEM 培养基重悬细胞，使细胞浓度达到1×105/mL；在Transwell 上室中加入200 μL 人真皮成纤维细胞悬液，下室分别加入500 μL DMEM基础培养基（空白）或含BM-ECM/Col 支架或Col支架（约5 mg 干质量）的DMEM 培养基，在37 ℃、体积分数为5% 二氧化碳培养箱中孵育12 h、24 h 后，取上室，用棉签彻底擦除滤膜上表面细胞，然后用结晶紫染色，显微镜观察并拍照，并按下列公式计算过膜细胞密度：细胞密度（/mm2）=视野内细胞数量÷视野面积（mm2）。复苏、消化和重悬细胞同趋化实验。将重悬的细胞接种于24 孔板，接种密度5.0×104/cm2，细胞贴壁后继续培养两三天，细胞长至80% 融合，用200 μL 移液器枪头在孔中央画1 条划痕，吸除培养基，加入1 mL DMEM 基础培养基（空白）或含BM-ECM/Col 支架或含Col 支架（约5 mg 干质量）的DMEM 培养基，在0 h、24 h、48 h 时，于100 倍镜下拍照并计算细胞向划痕中央迁移距离与初始距离的百分比。

1.4 统计学方法

所有数据采用SPSS 11.5 软件包进行分析。计量资料以均数±标准差（）表示，各组间数据的比较依据资料的性质，采用t检验或方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 支架微观结构

扫描电镜观察显示，BM-ECM/胶原蛋白支架和单纯胶原蛋白支架内部均呈相互连通多孔结构，孔径分布在100 μm 左右，见图1。两种支架的多孔结构和孔径差异无统计学意义（t=0.396,P=0.703）。

图1 两种支架内部结构的扫描电镜图片

2.2 傅里叶红外吸收光谱

两种支架都存在胶原蛋白肽键Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ特征吸收峰，分布在1 300～1 700 cm-1区间。相比单纯胶原蛋白支架，BM-ECM/胶原蛋白支架在1 235 cm-1出现特征峰，提示磺酸基团（S=O 伸缩震动）的存在；在1 200 cm-1的吸收峰强度增强，提示糖环（异头C-O-C 伸缩振动）的存在，见图2。磺酸基团和糖环的特征吸收峰表明BM-ECM/胶原蛋白支架中存在糖胺聚糖、低聚糖等细胞外基质分子。

图2 两种支架的傅里叶红外吸收光谱

2.3 小鼠皮下埋植支架中迁入细胞的密度

苏木精-伊红染色显示，术后5 d 时，细胞出现在两种支架的浅部区域，并有少量细胞散布于深部区域；术后10 d 时，BM-ECM/胶原蛋白支架深部区域出现大量细胞，单纯胶原蛋白支架的深部区域分布的细胞较少，见图3。定量结果显示，BM-ECM/胶原蛋白支架内部的代表性区域的细胞密度为（2.86±0.34）×103/mm2，高于单纯胶原蛋白支架（1.33±0.21）×103/mm2，差异有统计学意义（t=8.581,P＜0.001）。

图3 小鼠皮下埋植支架中的细胞迁入和分布情况（苏木精-伊红染色）

2.4 成纤维细胞在支架中的分布

通过抗小鼠ER-TR7 免疫染色显示了成纤维细胞在支架中的分布。术后10 d，BM-ECM/胶原蛋白支架内部的细胞大部分为ER-TR7 阳性，这些细胞在支架内部均匀分布。而单纯胶原蛋白支架中，ER-TR 阳性细胞集中分布于浅部区域，见图4。上述结果表明，成纤维细胞迁入BM-ECM/胶原蛋白支架的能力显著高于单纯胶原蛋白支架。

图4 小鼠皮下埋植支架中的成纤维细胞分布情况（抗ER-TR7 免疫染色和DAPI 细胞核染色）

2.5 支架对成纤维细胞趋化作用

孵育12 h 后，与单纯胶原蛋白支架和无支架相比，下室放置BM-ECM/胶原蛋白支架条件下，穿过Transwell 膜的人真皮成纤维细胞明显较多，见图5A；孵育24 h 后，BM-ECM/胶原蛋白支架、单纯胶原蛋白支架、无支架3 种条件下，相比12 h 时，过膜细胞均有所增多。定量分析结果显示，孵育12 h、24 h 后，相比单纯胶原蛋白支架或空白支架，BM-ECM/胶原蛋白支架作用下穿过Transwell 嵌套膜的细胞数均著增多，差异有统计学意义（F=79.96,P＜0.001），见图5B。

图5 支架对人成纤维细胞的趋化作用

2.6 支架对成纤维细胞迁移的影响

为了明确支架成分对细胞迁移运动的影响，评价了支架存在于基础培养基中时人真皮成纤维细胞划痕愈合情况。结果表明，BM-ECM/胶原蛋白支架存在于培养基中时，人真皮成纤维细胞划痕的愈合相比单纯胶原蛋白支架和无支架存在时明显增快，见图6A；24 h、48 h 后，BM-ECM/胶原蛋白支架作用下划痕愈合率均高于单纯胶原蛋白支架和空白组，差异有统计学意义（F=158.4,P＜0.001），见图6B。

图6 人成纤维细胞的划痕伤口愈合情况

3 讨论

缺乏诱导内源细胞迁移和迁入支架的调控活性是胶原蛋白支架有限促组织重建能力的关键原因。该研究的目的是建立一种增强胶原蛋白支架促进组织重建功能的方法，即通过引入体外培养和获取的BM-ECM 赋予胶原蛋白支架调控细胞运动以及迁入支架的活性。研究结果表明，BMECM/胶原蛋白支架为连通多孔结构，与胶原蛋白支架相似，BM-ECM 胶原蛋白支架促进细胞运动和迁入支架的能力相比单纯胶原蛋白支架显著增强。

为提高胶原蛋白支架促进细胞迁入的功能，基质细胞衍生因子-1（SDF-1）、血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）等生物活性因子被引入支架中以增强细胞在支架中的黏附和形成聚集态［7-8］。此外，有关骨髓间充质干细胞或其外泌体提高合成支架材料促组织修复性能的研究较多［9-11］。利用骨髓间充质干细胞或其外泌体诱导内源细胞迁入胶原蛋白支架，实现支架重塑和大鼠创面愈合［12］。这些方法广泛证实了通过引入生物活性因子改善胶原蛋白支架提高细胞迁入功能的可行性。但上述方法存在生物活性因子易失活、细胞存活率低、制备方法复杂等缺点。

BM-ECM 是以I 型胶原蛋白为主要成分且包含生长因子、趋化因子和蛋白聚糖等微量分子的混合物，因此，其提取过程简单且易于控制，并且BM-ECM/胶原蛋白支架的制备条件简单，具有与胶原蛋白支架相似的多孔结构。通过傅里叶红外吸收光谱检测糖胺聚糖的特征吸收峰能简便、快速确证BM-ECM 的引入。制备BM-ECM/胶原蛋白支架，在提高材料生物活性的同时，有望解决复杂制备工艺的问题。

组织缺损后募集内源细胞是组织重建的基础，利用生物材料为这些细胞提供三维空间是发挥细胞自身修复功能的基础，其前提是细胞迁入。引入胶原蛋白支架后，BM-ECM 显著增强内源性细胞迁入支架的能力，大部分细胞为间质细胞如ERTR7+成纤维细胞。与临床现有合成材料相比，部分异种组织脱细胞基质如膀胱脱细胞基质［13］、小肠黏膜下层脱细胞基质［14］、羊膜脱细胞基质等组织细胞外基质具有显著提高组织重建细胞迁入的活性［15］。组织细胞外基质来源水凝胶也显示了对软组织缺损修复能力以及对成血管细胞的促迁移活性［16］。BM-ECM 与上述细胞外基质在结构、组成上具有相似性［17］，除了I 型胶原蛋白，还含有糖胺聚糖、生物活性因子等调控细胞行为的生物大分子，是BM-ECM 促进成纤维细胞迁入胶原蛋白支架的关键成分。另外，相比通过加载生物活性因子如趋化因子和生长因子使胶原蛋白支架产生对成纤维细胞趋化活性和促进这些细胞迁入支架和促进组织新生活性的方法，本研究采用的BM-ECM 不仅制备方法简单，是天然的生物活性分子的螯合基质，有利于提高这些分子的生物利用度，产生优异的促组织新生效果。

细胞运动是软组织重建细胞迁入支架的关键过程，受到生物活性因子的调控。研究表明，细胞外基质中的纤连蛋白、血小板衍生生长因子-BB等生物活性因子的存在增强了成纤维细胞、肌细胞等细胞的趋化性和趋触性［18-20］。BM-ECM 不仅含有血小板衍生生长因子-BB、等生物活性因子［21］，还含有基底膜蛋白多糖等蛋白糖，其能提高生物活性因子的生物利用度［22-23］，增强细胞运动和迁移能力，这可能是BM-ECM 提高胶原蛋白支架促细胞迁入功能改善的重要机制。通过引入BM-ECM 使胶原蛋白支架具有促进细胞运动和迁入的活性，其中的关键生物活性因子及其作用机制有待进一步研究，为BM-ECM/胶原蛋白支架的优化及其在软组织缺损创面修复中的应用提供依据。

综上所述，本研究建立了一种增强胶原蛋白支架促进细胞迁入活性的方法，通过引入BMECM 使胶原蛋白支架产生诱导组织重建细胞迁入支架的活性，并且显著增强人真皮成纤维细胞的运动、迁移能力；构建的BM-ECM/胶原蛋白支架新材料具有在软组织缺损创面修复中的应用潜力。