陈清清， 吴云丽， 吴一波， 林玉玲， 闫小利， 邱慧娜， 张建明， 郑廷金， 张志珊

肠球菌对利奈唑胺耐药机制除主要为23S rRNA基因的突变外，移动遗传元件（MGE）相关的cfr、cfr（B）、optrA、poxtA等获得性耐药基因也起重要作用[4]，这些基因可随着质粒、转座子等在不同肠球菌和其他革兰阳性球菌中快速传播。耐药基因的存在及传播不仅加速了细菌耐药性的获得，而且增加了肠球菌相关感染性疾病的治疗难度。通过细菌分型可探究各菌株间的克隆关系，确定病原菌和感染源之间的关系，可为控制此类耐药菌的流行和交叉感染提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 采用常规细菌培养方法对福建医科大学附属泉州第一医院2018—2019年的临床微生物标本进行细菌培养，肠球菌属鉴定采用Phoenix100全自动细菌鉴定及药敏仪（美国BD公司）及MALDI-TOF细菌质谱鉴定仪（布鲁克公司）进行鉴定。

1.1.2 抗菌药物和培养基 抗菌药物纸片为英国OXOID公司产品，药敏试验所用的MH琼脂培养基为广州市迪景生物有限公司产品。商品化药敏板-革兰阳性菌药敏板PMIC/ID-55为美国BD公司的Phoenix100检测系统配套产品。CAMHB肉汤粉剂为青岛海博生物公司产品。利奈唑胺高纯度标准品（CAS：165800-03-3）为四川省维克奇生物科技有限公司产品。96孔药敏培养空板为艾斯特实验器材公司产品。

1.2 方法

1.2.1 药敏试验 采用革兰阳性菌药敏板PMIC/ID-55（美国BD公司）检测肠球菌的常规药敏试验及利奈唑胺的最低抑菌浓度（MIC）；采用药敏纸片法（K-B法）和肉汤微量稀释法（MIC法）对经仪器法检测出的利奈唑胺不敏感肠球菌（LISE）菌株进行确认。药敏试验质控菌株为粪肠球菌ATCC 29212，参照2019年美国临床和实验室标准化协会（CLSI）推荐的抗菌药物折点判读结果。

1.2.2 微量药敏板的制备 预制96孔肉汤微量稀释法的药敏培养板，根据纯度计算并称量药物配置浓度为1 280 mg/L的储存液，使用灭菌蒸馏水进行倍比稀释，将倍比稀释后不同浓度的抗菌药物溶液分别加到灭菌的96孔聚苯乙烯板中，于A～G的1～11列从上至下第1至第8孔加药液，每孔50 μL，MIC范围为0.5～64 mg/L，第12列不加药作为生长对照，加盖－80℃以下保存备用。

1.2.3 统计分析 采用WHONET 5.6 软件进行数据统计分析。

1.2.4 同源性分析 采用多位点序列分型（MLST）分析LISE菌株的同源性。

1.2.5 耐药基因检测 采用PCR法检测23S rRNA、rplC、rplD、rplV、optrA、poxtA、cfr、cfr（B）利奈唑胺耐药相关基因，并使用基因测序方法验证扩增的PCR产物，耐药基因PCR引物序列及扩增产物大小见表1。

表1 耐药基因PCR引物序列及扩增产物Table 1 Primer sequences for PCR detection of relevant drug resistance genes and amplicon size

2 结果

2.1 肠球菌属的菌种分布及药敏结果

2018—2019年共检出肠球菌属细菌522株，其中粪肠球菌332株，占63.6%；屎肠球菌121株，占23.2%；其他肠球菌69株，占13.2%，见表2。除利奈唑胺、四环素外，屎肠球菌对其他测试药物的耐药率明显高于粪肠球菌，见表3。经MIC法复核确认检出LISE 44株，均为粪肠球菌，其中中介粪肠球菌（LIEf）16株，占4.8%（16/332），MIC值为4 mg/L；耐药粪肠球菌（LREf）28株，占8.4%（28/332），有25株MIC值为8 mg/L，3株MIC值为16 mg/L。

表2 522株肠球菌属的菌种分布Table 2 Species distribution of 522 Enterococcus strains

表3 肠球菌属细菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Table 3 Susceptibility of Enterococcus species to antimicrobial agents （%）

2.2 LISE菌株的科室和标本类型分布

LISE菌株科室分布中泌尿外科占43.2%（19/44），肿瘤科占9.1%（4/44），老年病科和肝胆外科均为6.8%（3/44），其他分别为神经外科、胃肠外科、内分泌科、甲状腺外科、烧伤科等；标本类型中尿液占52.3%（23/44）、抽出液占18.2%（8/44）、分泌物占13.6%（6/44）、引流液占4.5%（2/44）、其他占11.4%（5/44）。

2.3 LISE菌株的耐药基因检测结果

选取与利奈唑胺耐药相关的基因23S rRNA、rplC、rplD、rplV、optrA、poxtA、cfr、cfr（B）进行检测，44株LISE菌株optrA基因阳性的23株，cfr基因阳性的1株，poxtA基因阳性的1株，23S rRNA发生基因突变（G2601C）的1株，编码L3核糖体蛋白的rplC基因发生突变 （C291T、C369T、T107A）的有4株，编码L4核糖体蛋白的rplD基因发生突变 （C348T、A144G）的有19株，编码L22核糖体蛋白的rplV基因未发生突变，见表4。

表4 LREf和LIEf菌株耐药基因及耐药表型Table 4 Drug resistance genes and resistance phenotypes of linezolid-resistant and linezolid-intermediate Enterococcus faecalis strains

2.4 MLST分析

将44株LISE的7个管家基因（pstS、gdh、gyd、xpt、yiqL、aroE、gki）上传至 MLST 官网进行比对，共有32个ST型，其中9株为ST16型，ST480、ST689、ST995、ST985型各2株，其他分别为ST179、ST302、ST975、ST991等，共有13个新的ST型（ST975、ST976、ST978～ST981、ST984、ST985、ST987、ST990、ST991、ST995、ST1003），见表 5。

表5 44株LISE菌株的MLST分布Table 5 Multilocus sequence typing of 44 linezolid-insensitive Enterococcus strains

3 讨论

2018－2019年我院粪肠球菌药敏结果显示其对利奈唑胺的耐药率为8.4%，高于CHINET监测网显示2018－2019年粪肠球菌对利奈唑胺的耐药率（2.2%）。从临床上共分离44株LISE，其中28株为 LREf，16株为 LIEf。28株 LREf的 MIC值为8～16 mg/L，目前对于肠球菌利奈唑胺耐药水平的定义尚无共识，有文献建议将MIC范围为8～16 mg/L定义为低水平的耐药，将MIC＞64 mg/L定义为高水平的耐药[5]。低水平的耐药可能成为发展更高水平耐药性的“垫脚石”，这可能导致医院“超级细菌”的产生[6]。44株LISE分离的科室主要为泌尿外科、肿瘤科、老年病科和肝胆外科，标本来源主要为尿液、抽出液、分泌物、引流液。

23S rRNA的V区点突变是目前LRE菌株最普遍的耐药机制且具有多样性，主要的突变类型为G2576T，其次为G2447T、G2505A[7]。本研究结果显示LRE-EF03的23S rRNA发生了G2601C点突变，引起了Q867H氨基酸的改变，该菌株同时携带optrA基因，与美国LEADER项目报道的肠球菌携带optrA基因同时发生23S rRNA G2576T的突变位置不同[8]。

我院粪肠球菌检测出1株cfr阳性的LRE，命名为EF02，该菌株同时携带optrA，利奈唑胺对其的MIC值为8 mg/L，基因型为ST330。cfr编码一种rRNA甲基转移酶，可引起唑烷酮类、氯霉素类、林可霉素类、截短侧耳素类和链霉菌素A耐药和大环内酯类敏感性下降[9]。自2012年首次报道了由质粒携带cfr基因介导人源粪肠球菌（ST16）对利奈唑胺耐药以来[10]，逐渐出现了一些类似的报道[11-14]。2015年Wang 等[11]第一次报道了optrA耐药基因来自于国内人和动物分离的肠球菌，为cfr之后报道的第2个可转移性利奈唑胺耐药基因，该基因很容易在肠球菌之间转移[11，15-16]。本研究44株LISE菌株optrA基因阳性的有23株，占52.3%，其中21株为LREf，2株为LIEf。2018年报道了在意大利临床分离的高度耐利奈唑胺MRSA中检测到1种新的耐药基因poxtA，其在金黄色葡萄球菌、肠球菌中的表达可导致对酚类、唑烷酮类和四环素类药物敏感性降低[17]。2019年国内研究者发现了1株猪源粪肠球菌携带了1个具有optrA和poxtA基因的质粒[18]，我院LRE菌株中亦发现了EF94同时携带optrA和poxtA。根据目前文献报道，EF02和EF94均为国内首次发现同时携带两种耐药基因的人源粪肠球菌。

核糖体蛋白L3、L4或L22突变可能是造成利奈唑胺非转移性耐药的另一种机制。有研究显示由rplC和rplD编码的核糖体蛋白L3和L4保守结构域的改变与利奈唑胺非敏感肠球菌（MIC 4～8 mg/L）有一定的相关性[19]。本研究的44株LISE中有23株发生点突变（rplC4株，rplD19株），其中只有LIEf-EF04的rplC发生了L36del （T107A）突变，其他22株虽发生点突变但并未引起氨基酸的改变，其中13株合并optrA且有11株为LRE。

MLST分析显示44株LISE可分为32个不同的ST型，ST16最为多见（9/44）且有7株携带optrA，利奈唑胺对其的MIC值为8～16 mg/L，与国内刘畅[20]和楼亚玲[21]报道的LRE菌株中ST16（均携带optrA）为最常见型别一致。而与葡萄牙[22]检出的optrA阳性粪肠球菌的基因型为ST476（5/28） 和 ST585（3/28） 不 一 致。44株LISE出现了新的ST型，说明菌株也在不断进化以应对艰难的生存环境。ST16-179-302-985复合群（EF13、EF29、EF34、EF42、EF43、EF51、EF60、EF78） 与 ST480-689复 合 群（EF04、EF16、EF58、EF86）分布在泌尿外科，提示泌尿外科存在ST16型与ST480为主的多克隆传播现象。其他ST型菌株分布于各个科室，呈散在流行，不存在院内克隆传播。

LRE菌株optrA的高携带率表明其为我院LRE的主要耐药机制，且可作为利奈唑胺耐药性筛查的有效分子标志。另外，需要进一步常规和持续筛选患者携带optrA基因菌株的危险因素，这些因素可能与利奈唑胺耐药性的快速传播有关。44株LISE中有9株未发现其他耐药机制。细菌生物膜的形成在细菌适应性耐药方面被认为能够导致细菌耐药性增强，因此不能排除生物膜形成有助于降低对利奈唑胺敏感性的可能性。有研究通过透射电子显微镜进行观察比较利奈唑胺敏感肠球菌与LISE的生物膜，与敏感株相比，LISE的菌体细胞壁往往更厚[23]。生物膜是否参与了LISE对利奈唑胺的耐药形成有待进一步探究。