孙悦龙，张梦洁，豆佳红,2，王小莹，戴小枫，李秀梅

(1.中国农业科学院饲料研究所，农业农村部饲料生物技术重点实验室，北京 100081；2.天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

仔猪腹泻是仔猪生长过程中普遍存在、危害严重的一类疾病，轻则减缓仔猪生长发育，重则导致仔猪脱水死亡[1]，给养殖业带来重大经济损失。仔猪消化器官不发达，消化酶含量处于较低水平，肠道免疫系统尚未成熟，极易受到病原菌的侵扰和外界环境的影响[2]。已有研究表明，肠道微生物被认为是宿主的“第二基因组”，当仔猪肠道菌群的类型、数量、结构等发生变化，菌群的相关代谢活动发生相应变化，肠道菌群失调，仔猪易发生腹泻[3]。目前，对于仔猪腹泻的治疗方式仍以抗生素为主，抗生素的长期使用，易产生超级耐药菌和污染环境，寻求新的药物治疗方式显得尤为重要。中草药作为一种绿色、多靶点的药物，已成为研究热点。

黄芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bunge.)用于气虚乏力、食少便溏、中气下陷、久泻脱肛、便血崩漏、表虚自汗、气虚水肿、内热消渴、血虚萎黄、久溃不敛等症，具有抗氧化、抗炎、免疫调节等作用[4]。尹佳婷等[5]采用小鼠自然衰老模型，验证了黄芪能增加小鼠肠道微生物多样性，恢复肠道稳态。张阳等[6]在生长育肥猪基础饲粮中添加0.1%黄芪多糖显著降低了猪粪便微生物的多样性。但鲜有研究报道黄芪对仔猪肠道菌群失调性腹泻的调节作用，因此，本研究运用网络药理学及分子对接技术研究了黄芪用于调控仔猪肠道菌群失调性腹泻的有效活性成分及其潜在作用机制，以期为黄芪的应用及进一步试验研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 黄芪主要活性成分及作用靶点的搜集

利用中药药理学数据库TCMSP[7](https:∥old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)搜集黄芪的活性成分，设置口服吸收利用度(oral bioavailablity，OB)≥30%，类药性(drug-likeness，DL)≥0.18[8]进行筛选，并通过TCMSP数据库进一步搜集相关活性成分的靶点，在Uniprot数据库(https:∥www.uniprot.org/)中进行标准化。利用Cytoscape_3.8.0软件构建黄芪活性成分-潜在作用靶点网络图。

1.2 肠道菌群失调性腹泻相关靶点及交集靶点的获取

以“flora imbalance diarrhea”为关键词，于GeneCards(https:∥www.genecards.org/)和OMIM(https:∥omim.org/)数据库中进行肠道菌群失调性腹泻疾病靶点搜集并去重后，在Uniprot数据库中获取靶点简称，设置物种为Susscrofa进行标准化，建立疾病靶点数据集。利用Venny_2.1.0软件(https:∥bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)对黄芪活性成分与肠道菌群失调性腹泻疾病靶点取交集得到交集靶点，并制作Venn图。

1.3 黄芪-活性成分-作用靶点-疾病相互作用网络构建

将1.1中获得的黄芪活性成分与1.2中获得的交集靶点导入Cytoscape_3.8.0软件，构建黄芪-活性成分-作用靶点-肠道菌群失调性腹泻网络图。

1.4 黄芪与肠道菌群失调性腹泻蛋白-蛋白相互作用网络构建与拓扑分析

将1.2中获取的交集靶点导入STRING数据库(https:∥cn.string-db.org/)，设置物种为Susscrofa，获得蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络图，分析交集网络中节点的属性值，并导出文件，利用Cytoscape_3.8.0软件进行拓扑分析。

1.5 GO功能与KEGG通路富集分析

将1.2中获得的交集靶点导入DAVID数据库(https:∥david.ncifcrf.gov/summary.jsp)，设置物种为Susscrofa，进行GO功能和KEGG通路富集分析，获得黄芪调控仔猪菌群失调性腹泻的潜在通路。

1.6 分子对接验证

选取PPI网络中前10个关键靶点和对应的黄芪活性成分进行分子对接。利用PubChem数据库(https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)下载黄芪活性成分化合物2D文件，导入Chem3D_20.0.0.41中以最小能量进行3D转换并保存为mol2格式文件，经AutoDuckTools_1.5.7转化为pdbqt格式文件。利用PDB数据库(https:∥www.rcsb.org/)下载关键靶点的三维晶体结构，经Pymol软件去除水分子和配体，导入至AutoDuckTools_1.5.7进行加氢、分配电荷、添加原子类型后保存为pdbqt格式文件。将上述两部分经AutoDuck_4.2.6进行分子对接，对接结果经Pymol_2.4.0可视化。

2 结 果

2.1 黄芪主要活性成分及作用靶点

基于TCMSP数据库共获得87个活性成分，以OB≥30%、DL≥0.18为筛选条件，筛选出20个活性成分。将活性成分作用靶点经Uniprot数据库中已认证的猪基因进行标准化，得到11个活性成分(表1)，对应119个作用靶点，去重后得到65个潜在靶点。

表1 黄芪主要活性成分

将黄芪11个主要活性成分及作用靶点导入Cytoscape_3.8.0软件进行映射，构建黄芪主要活性成分-药物靶点网络可视化；得到77个节点(节点表示黄芪活性成分和药物靶点)和130条边(边表示黄芪活性成分和靶点之间的相互作用)(图1)。

正方形代表中药；六边形代表黄芪的有效成分；菱形代表黄芪作用靶点Square represents traditional Chinese medicine；Hexagon represents effective components of Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge.；Diamond represents targets of Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge.图1 黄芪主要活性成分-靶点网络图Fig.1 Active ingredients-target network of Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge.

2.2 菌群失调性腹泻相关靶点及交集靶点

经GeneCards和OMIM数据库检索，分别得到菌群失调性腹泻靶点258、873个，去除重复项后共计854个靶点，将其与2.1得到的药物靶点经Venny_2.1.0软件取交集得到靶点25个(图2)，分别为半胱氨酸蛋白酶-3(CASP3)、C-C基序趋化因子2(CCL2)、C-反应蛋白(CRP)、重组白细胞介素-8(CXCL8)、雌激素受体(ESR1)、雌激素β受体(ESR2)、血红素加氧酶1(HMOX1)、热休克蛋白β-1(HSPB1)、γ干扰素(IFNG)、白细胞介素-10(IL10)、IL1A、IL1B、IL2、IL4、IL6、干扰素调控因子1(IRF1)、转录因子AP-1(JUN)、Myc原癌基因蛋白(MYC)、NF-κB抑制剂α(NFKBIA)、诱导型一氧化氮合酶(NOS2)、Mu型阿片受体(OPRM1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)、抗白细胞蛋白酶(SLPI)、肿瘤坏死因子(TNF)、细胞肿瘤抗原p53(TP53)。

图2 黄芪与菌群失调性腹泻交集靶点Venn图Fig.2 Venn diagram of intersection targets of Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge.and flora imbalance diarrhea

2.3 黄芪-活性成分-作用靶点-疾病相互作用网络构建

整合黄芪、活性成分、菌群失调性腹泻靶点，导入Cytoscape_3.8.0软件构建黄芪-活性成分-作用靶点-菌群失调性腹泻网络图，结果见图3。

圆形代表疾病；正方形代表中药；六边形代表中药的有效成分；菱形代表黄芪作用靶点Circle represents disease；Square represents traditional Chinese medicine；Hexagon represents active ingredient of traditional Chinese medicine；Diamond represents target of Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge.图3 黄芪-活性成分-作用靶点-疾病网络图Fig.3 Network model of Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge.-chemical components-target-disease

由图3可知，试验得到36个节点和105条边，25个交集靶点对应黄芪9个活性成分，分别为槲皮素(MOL000098)、华良姜素(MOL000239)、异鼠李素(MOL000354)、美迪紫檀素(MOL000371)、7-O-甲基异微凸剑叶莎醇(MOL000378)、(6aR,11aR)-9,10-二甲氧基-6a,11a-二氢-6H-苯并吡喃[3,2-c]-3-醇(MOL000380)、芒柄花素(MOL000392)、毛蕊异黄酮(MOL000417)、山奈酚(MOL000422)。不同活性成分平均作用6.3个靶点，其中，槲皮素作用于20个靶点，山奈酚作用于8个靶点，芒柄花素作用于7个靶点；不同疾病靶点平均对应3.84个活性成分，体现了中草药多成分与多靶点共同作用的整体性。

2.4 黄芪与菌群失调性腹泻PPI网络构建

将获取的25个交集靶点导入STRING数据库，设置物种为Susscrofa，选择置信度≥0.04，去除游离蛋白，获得23个靶点的PPI网络图。由图4可知，共有23个蛋白节点和680条边，平均节点度为29.6。各靶点间具有良好的蛋白交互作用，其中JUN和TNF靶点度值最高，为42，其次是IL6和CASP3，度值为40。

图4 交集靶点PPI网络图Fig.4 PPI network of the common targets

根据节点度值绘制所有靶点蛋白的柱形图。由图5可知，黄芪与菌群失调性腹泻靶点中的JUN、TNF、IL6、CASP3、IL1B、NFKBIA、TP53、IL10、CCL2和PPARG等有较大互作频率，说明黄芪可能通过以上靶点调控仔猪肠道菌群失调性腹泻，这些靶点在黄芪调控仔猪肠道菌群失调性腹泻的作用机制中可能发挥重要作用。

图5 交集靶点度值Fig.5 Degree of the common targets

将蛋白互作分析结果导入Cytoscape_3.8.0软件绘制交互网络图，进行拓扑分析。由图6可知，JUN、TNF、IL6、CASP3、IL1B、NFKBIA、TP53、IL10、CCL2和PPARG间具有较好的PPI，其中IL1B和IL1A的互作评分为0.991，TNF和JUN的互作评分为0.985，IL6和JUN的互作评分为0.978。表明黄芪可能通过TNF、JUN、IL1B、IL6等靶点调控仔猪肠道菌群失调性腹泻。

图6 交集靶点相互作用网络图Fig.6 Network model of common targets

2.5 GO功能和KEGG通路富集分析

为进一步探讨黄芪治疗菌群失调性腹泻的作用机制，将交集靶点导入DAVID数据库，得到GO功能富集条目94条，其中生物过程(biological process，BP)74条，细胞组分(cellular component，CC)6条，分子功能(molecular function,MF)14条；KEGG通路61条。

选取排名前10的GO功能富集条目绘图，结果见图7。由图7可知，生物过程主要包括RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控(positive regulation of transcription from RNA polymeraseⅡ promoter)、免疫反应(immune response)、序列特异性DNA结合转录因子活性的正调控(positive regulation of sequence-specific DNA binding transcription factor activity)、转录正调控，DNA模板(positive regulation of transcription,DNA-templated)等；细胞组分包括胞外间隙(extracellular space)、细胞核(nucleus)、核染色质(nuclear chromatin)、质膜外侧面(external side of plasma membrane)等；分子功能主要包括细胞因子活性(cytokine activity)、转录因子活性,序列特异性DNA结合(transcription factor activity,sequence-specific DNA binding)、DNA结合(DNA binding)、相同蛋白结合(identical protein binding)等。

图7 GO功能富集分析柱形图Fig.7 Column chart of GO function enrichment analysis

选取排名前20的KEGG富集通路绘图，结果见图8。由图8可知，黄芪调控菌群失调性腹泻的靶点主要涉及以下KEGG通路：美国锥虫病(American trypanosomiasis)、百日咳(pertussis)、炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)、利什曼病(leishmaniasis)等。

图8 KEGG通路富集分析气泡图Fig.8 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis

2.6 分子对接

由图3可知，黄芪调控仔猪菌群失调性腹泻的主要活性成分为槲皮素、山奈酚和芒柄花素。由图4可知，槲皮素、山奈酚、芒柄花素作用的靶点主要为TNF、JUN、CASP3、IL6、NFKBIA、IL1B、IL10、TP53、PPARG和CCL2。基于此，将上述靶点分别与其相对应的黄芪活性成分进行分子对接，并计算最低结合能，结果见表2。结合能<0表示2个分子能自发结合，结合能越小，分子结合能力越强，构象越稳定。由表2可知，上述10个靶点与黄芪活性成分表现出不同的结合能力，其中，结合能最低的是芒柄花素与PPARG靶点的结合，结合能为-6.19 kJ/moL，其次是槲皮素与IL1B靶点的结合，结合能为-5.37 kJ/moL，槲皮素与TNF靶点的结合能为-5.10 kJ/moL，山奈酚和TNF靶点的结合能为-5.30 kJ/moL。

表2 黄芪主要活性成分与蛋白最低结合能

由图9可知，芒柄花素结合到PPARG，与异亮氨酸(Ile)-281残基形成氢键相互作用，键长2.2；槲皮素结合到IL1B，与天冬酰胺(Asn)-99、色氨酸(Trp)-98、天冬氨酸(Asp)-63残基形成氢键相互作用，平均键长2.16；槲皮素结合到TNF，与甘氨酸(Gly)-142、亮氨酸(Leu)-145、苏氨酸(Thr)-138残基形成氢键相互作用，平均键长2.3；山奈酚结合到TNF，与半胱氨酸(Cys)-150、苯丙氨酸(Phe)-143、甘氨酸(Gly)-142、苏氨酸(Thr)-138、亮氨酸(Leu)-145和半胱氨酸(Cys)-139残基形成氢键相互作用，平均键长2.4。

A,疾病靶点；B,氢键；C,黄芪主要活性成分A，Disease target；B,Hydrogen bond；C,Main active ingredients图9 关键靶点与活性成分的分子对接Fig.9 Molecular docking of important targets and active ingredients

3 讨 论

研究表明，肠道菌群在保护宿主健康中发挥着重要作用。仔猪在受到外界环境、抗生素药物等影响下，肠道菌群失调，正常菌群丰度减少，条件致病菌等病原微生物丰度得到提高，诱发机体产生免疫应答反应[9]。腹泻是肠道菌群失调的临床表现之一，一旦仔猪发生腹泻，若没有得到及时救治，极易导致大量仔猪脱水死亡[10]。

本研究通过网络药理学构建了“黄芪-活性成分-潜在靶点”和“黄芪-活性成分-靶点-疾病”网络图，最终筛选到9个主要活性成分，主要为槲皮素、华良姜素、异鼠李素、美迪紫檀素、7-O-甲基异微凸剑叶莎醇、芒柄花素、毛蕊异黄酮和山奈酚等，对应25个交集靶点。

PPI结果显示，黄芪与菌群失调性腹泻靶点中的JUN、TNF、IL6、CASP3、IL1B、NFKBIA、TP53、IL10、CCL2、PPARG等有较大互作频率。前10个靶点所对应的黄芪活性成分主要为槲皮素、山奈酚、芒柄花素。槲皮素是一种天然的黄酮类物质，存在于各种植物的花、叶、果实等之中，具有良好的抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抑菌、调节肠道微生物多样性等生物活性，且具有较高的食用安全性[11]。研究表明，槲皮素能提高肠道中拟杆菌门的丰度，降低变形杆菌的丰度，具有良好的调节机体菌群平衡的能力[12]。陈樱萌等[13]通过光电比浊法观测槲皮素对小鼠肠道菌群失调的调节作用，结果显示，槲皮素对肠球菌表现为强烈抑制作用，对乳杆菌表现为一定程度的促生长作用。山奈酚是一种天然的黄酮醇类物质，存在于水果、蔬菜及药食同源植物中，具有保护神经、抗脑血管疾病、防治代谢型疾病、缓解肠道炎症等作用[14-15]。曲一帆[16]研究表明，山奈酚能增加结肠长度，调节结肠中炎性转录因子的转录，上调紧密连接蛋白表达，并进一步通过提高厚壁菌门与拟杆菌门的比例，降低变形杆菌等致病菌相对丰度，增加肠道菌群多样性和丰富度。芒柄花素是广泛存在于红三叶草、黄芪等中的黄酮类物质，具有较强的抗肿瘤、抗氧化、抗炎等作用[17]。尽管芒柄花素被证实能有效抑制肿瘤细胞的转移扩散[18]和改善肠道屏障[19]，但没有直接证据表明芒柄花素能够调整肠道微生物多样性。

在黄芪调控菌群失调性腹泻关键靶点中，JUN是DNA结合蛋白，是转录因子AP-1的组成部分，转录因子AP-1的活性收到丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的调控。当机体肠道受到病原微生物侵染后，肠道上皮细胞MAPK通路被激活，从而诱导转录因子AP-1的DNA结合活性，进而产生IL-8[20]。TNF、IL6、IL1B、IL10等与炎症有关，可能是黄芪免疫调节的核心靶点[21]，当机体受到病原微生物侵染发生炎症反应时，其水平升高并激活相关信号通路，调节巨噬细胞等非特异性免疫，还可进一步激活特异性免疫释放炎症因子[22]。CASP3在细胞凋亡中起到重要作用，研究表明，细胞凋亡过程实际为Caspase被激活进而发生凋亡蛋白酶的级联反应，当宿主发生氧化应激后，凋亡诱导因子自线粒体释放至胞浆中，激活CASP3，诱导细胞凋亡[23-24]。NFKBIA通过屏蔽NF-κB蛋白的核定位信号将其隔离在细胞质中抑制NF-κB信号通路，NF-κB信号通路的激活可调节一系列与炎症和免疫相关的基因表达[25]。TP53是蛋白质和基因组的保护者，在防止基因组突变中起着保持稳定的作用，此外，TP53在控制氧化应激、DNA损伤、调控核糖体功能障碍和缺氧等方面发挥免疫作用[26]。CCL2又称单核细胞趋化蛋白-1(MAP-1)，是首个发现的人类CC趋化因子家族成员，研究发现，大多数趋化因子都能作为促炎因子参与感染、炎症等机体生理和病理过程，目前，趋化因子已被确定为多种疾病的潜在治疗靶点[27]。PPARG参与多种代谢途径，通过控制脂肪酸的过氧化物酶体β-氧化途径，调节脂肪细胞分化和葡萄糖稳态，还可介导肠道脂质代谢，影响肠道中脂质生成、脂质吸收和脂质转运[28]。

GO功能富集分析显示，黄芪治疗菌群失调性腹泻的过程主要富集在转录调控、免疫反应、细胞对脂多糖的反应等。KEGG通路富集结果表明，黄芪治疗仔猪菌群失调性腹泻主要与美国锥虫病、炎症性肠病、阿米巴病、细胞因子-细胞因子受体相互作用、A型流感、疟疾、T细胞受体信号通路、沙门菌感染等信号通路密切相关。通过对KEGG代谢通路的富集分析发现，造成仔猪腹泻的可能原因主要为病原微生物入侵后诱发的炎症反应。同时，本研究发现，在多个信号通路中存在交集靶点，如黄芪可通过调控IL10、NFKBIA、JUN、IL6、CCL2、TNF等靶点对美国锥虫病发挥作用，还可通过调控IL10、JUN、IL6、TNF等靶点对炎症性肠病发挥作用等，进一步说明了黄芪在仔猪菌群失调性腹泻方面并非通过一个靶点进行治疗的，而是通过多靶点进行疾病治疗[29]。

黄芪主要活性成分与靶点分子对接结果显示，槲皮素与TNF、IL1B具有良好的结合活性，山奈酚与TNF具有良好的结合活性，芒柄花素与PPARG具有良好的结合活性。研究表明，肠道中革兰氏阴性菌产生的脂多糖作为炎症触发因子激活 NF-κB 信号通路，促进炎性因子 TNF-α、IL6、IL1B的合成和释放，从而导致肠道组织产生炎症[30]；槲皮素、山奈酚可通过调节肠道菌群和增强肠道屏障功能，减少脂多糖的产生，减少肠道炎症反应[31]；此外，槲皮素能通过降低TNF-α、IL6和IL1B的表达水平，进而抑制肠道炎症反应[32]。这与GO功能和KEGG通路富集分析结果相一致，即黄芪通过调节细胞对脂多糖的反应或增强肠道屏障，减少病原微生物入侵治疗仔猪菌群失调性腹泻。已有研究证明，芒柄花素参与多种炎症反应，可降低炎性因子的表达水平[33]，本研究中芒柄花素与PPARG具有较好的结合能力，这还有待于进一步分析。同时，本研究再次证明了中草药在治疗疾病时是由多个活性组分发挥作用的。

4 结 论

本研究结果表明，黄芪调控仔猪菌群失调性腹泻的主要活性成分可能为槲皮素、华良姜素、异鼠李素、芒柄花素、毛蕊异黄酮、山奈酚等，涉及的核心靶点主要有JUN、TNF、IL6、CASP3、IL1B、NFKBIA、TP53、IL10、CCL2、PPARG，黄芪调控仔猪菌群失调性腹泻的可能通路主要为美国锥虫病、炎症性肠病、阿米巴病、细胞因子-细胞因子受体相互作用、A型流感、疟疾、T细胞受体信号通路、沙门菌感染等，为黄芪后期的研究和开发提供了参考依据。