程成鹏，贺稚非,2，唐春，李芳，廖林，李洪军,2*

1(西南大学 食品科学学院，重庆，400715)2(重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆，400715) 3(四川高金实业集团股份有限公司，四川 遂宁，629000)

猪大肠又叫猪脏、肥肠、葫芦头，是猪的内脏器官，包括盲肠、结肠和直肠，管壁分为黏膜层、黏膜下层、肌肉层、浆膜层，是我国饮食体系中常见的食材。同时猪大肠在中医体系中还有润燥、补虚、止渴止血等医疗养生价值[1]。但猪大肠存在口感坚韧，久煮不烂的缺点。

嫩度是影响肉感官的重要因素之一[2-3]，其在消费者的购买决策中，尤其是重复性购买中起着重大的作用。嫩度受到一系列生物和环境因素的影响，例如肌肉组成、脂肪含量、畜种和品种、钙蛋白酶及钙蛋白酶抑制蛋白、宰前和宰后的处理等[4]。目前物理嫩化方法主要有冲击波法、超高压法、滚揉法等。滚揉嫩化是通过机械作用对肉进行翻滚、摔打从而使肉质表面结构松软柔嫩，但这种方法存在交叉污染的风险[5]。超高压技术是通过高压破坏肌浆网膜和溶酶体膜，激活钙蛋白酶，增加胞浆内组织蛋白酶数量，从而降解肌原纤维蛋白，肉品得到嫩化，但该方法可能对肉品的色泽、持水力和风味造成一定的负面影响[6]。冲击波是指在几分之一毫秒产生的高达1 GPa的压力波，具有低成本、效率高的优点，该技术最先应用于牛肉的嫩化，但其对产品包装要求较高，商业化推广具有一定的局限性[7]。化学嫩化方法中常用嫩化剂主要有盐类、有机酸、磷酸盐等[8]。这些化学物质主要是通过改变蛋白质溶解度或影响蛋白酶作用从而提高食品嫩度[8]。生物嫩化方法主要是利用外源蛋白酶消化结缔组织和肌肉蛋白质[9]，降低肉的剪切力，从而达到嫩化的效果。目前，木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、猕猴桃蛋白酶的应用较为广泛，其中木瓜蛋白酶为含疏基肽链内切酶，稳定性高，对蛋白质、多肽类、酯类等物质有着较强的水解能力[10-11]，可以作用于胶原蛋白和弹性蛋白从而水解肌肉蛋白并增加肉的嫩度[12]。

本研究通过响应面设计，以NaOH、木瓜蛋白酶为嫩化方法，对猪大肠进行嫩化处理，以得率、蒸煮损失、剪切力和感官评分为评价手段，对比研究化学和生物方法对猪大肠嫩化的最佳条件，填补猪大肠嫩化研究的空白，以期为猪大肠嫩化方法提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

猪大肠由四川高鑫食品股份有限公司提供，于-18 ℃的环境下贮藏。

1.2 主要试剂

NaOH，重庆跃翔化工有限公司；NaHCO3(纯度≥99%)、CaCl2(纯度≥99%)，均为分析纯，上海源叶生物科技有限公司，木瓜蛋白酶(5万U/g)、菠萝蛋白酶(3万U/g)，河北万邦实业有限公司。

1.3 仪器与设备

FA214A分析天平，上海豪晟科学仪器有限公司；C-LM3B型数显式肌肉嫩度仪，北京天翔飞域仪器设备有限公司；磁力搅拌水浴锅，常州恩培仪器制造有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 单因素试验

研究不同NaOH质量浓度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L)、时间 (20、25、30、35、40 min)和温度(25、30、35、40、45 ℃)对猪大肠嫩化效果的影响。研究不同木瓜蛋白酶质量浓度(1.6、1.8、2.0、2.2、2.4 g/L)、时间(70、80、90、100、110 min)和温度(25、30、35、40、45 ℃)对猪大肠嫩化效果的影响。

1.4.2 样品嫩化处理

将猪大肠置于4 ℃条件下解冻12 h，去除表面可见脂肪，清洗干净，将其分为大小均匀,质量约3.5 g的肉块,每10 g猪大肠为1组。之后按照料液比1∶10(g∶mL)放入盛有嫩化剂的烧杯中，在恒温水浴锅中进行浸泡处理，一定时间后将猪大肠取出。

1.4.3 制成率测定

先将猪大肠水分滤干，之后用滤纸吸干表面水分，准确称其质量并记录，制成率计算如公式(1)所示:

(1)

1.4.4 剪切力的测定

参照文献[13-14]的方法，稍作修改，取适量猪大肠肉按照上述方法嫩化处理后，置于蒸煮袋中在90 ℃条件下进行恒温水浴加热，20 min后取出样品。将处理好的样品切成1 cm×1 cm×5 cm的长方体，用嫩度仪进行测试,每个样品测3次取其平均值。

1.4.5 蒸煮损失测定

参考李明奇等[13]的方法稍做修改，将处理后的肉进行称重，记为m1，然后置于蒸煮袋中，于90 ℃恒温水浴锅中蒸煮20 min后取出，用滤纸吸干表面水分并称重，记为m2，每个样品需平行测定3次。蒸煮损失计算如公式(2)所示：

(2)

1.4.6 感官评定

参考SALLAM[15]的方法略作修改，经过感官评定实验培训，选择10名(5男5女)食品科学学院研究生组成感官评价小组，按照感官评定实验要求，对嫩化后的猪大肠色泽、咀嚼性、气味、硬度和风味进行感官评定，感官评分标准见表1。

表1 感官评分标准Table 1 Sensory evaluation standards

1.4.7 响应面设计

以NaOH质量浓度、时间和温度为自变量进行单因素试验，感官评分为响应值，用Design-Expert 8.0.6.1进行响应面试验设计。试验各因素水平见表2。

表2 感官评分响应面优化的因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface optimization on sensory score

以木瓜蛋白酶质量分数、时间和温度为自变量进行单因素试验，以剪切力为响应值，用Design-Expert 8.0.6.1进行响应面试验设计。试验各因素水平见表3。

表3 剪切力响应面优化的因素水平表Table 3 Factors and levels of response surface optimization on shear force

1.5 数据处理

所有数据均采用Design-Expert.V8.0.6.1软件进行响应面分析, 单因素方差分析采用SPSS Statistics 19.0软件进行处理，采用Origin 2018绘图。

2 结果与分析

2.1 不同嫩化剂对猪大肠嫩化效果对比

由图1可知，NaHCO3、菠萝蛋白酶对猪大肠剪切力影响比NaOH和木瓜蛋白酶小，CaCl2使猪大肠剪切力增加。NaOH、木瓜蛋白酶能够明显降低剪切力，其中NaOH降低猪大肠剪切力效果最好，但蒸煮损失比木瓜蛋白酶大。可能是因为猪大肠在碱液中表面膜和结缔组织被部分破坏，蛋白质结构发生改变。木瓜蛋白酶水解胶原蛋白和弹性蛋白从而增加猪大肠的嫩度[8]。因此，综合考虑选择NaOH和木瓜蛋白酶这2种嫩化剂进行工艺优化。

图1 不同嫩化剂对猪大肠的嫩化效果对比结果Fig.1 Comparison of tenderizing effect of different tenderizing agents on pig large intestine

2.2 单因素试验结果

2.2.1 NaOH质量浓度对猪大肠品质的影响

由图2可知，随着NaOH质量浓度的增加，得率呈现先上升后降低的趋势，当NaOH质量浓度达到1 g/L时，得率达到最大，此时猪大肠吸水最多。NaOH质量浓度在0.5～2 g/L时，蒸煮损失显著下降。当达到2 g/L时，蒸煮损失达到最小。NaOH质量浓度在0.5～1 g/L时，剪切力显著下降，而感官评分显著增加，达到最大值。之后随着浓度的增加，剪切力和感官评分都有下降，但不显著。这可能是因为适当浓度的碱液能够使蛋白质溶解暴露亲水基团，从而提高吸水性和降低剪切力。当碱的浓度过大，会破坏猪大肠结构，吸水过多，从而降低口感[16]。

a-得率和蒸煮损失；b-剪切力和感官评分图2 NaOH质量浓度对猪大肠品质的影响Fig.2 Effect of NaOH concentration on the quality of pig large intestine

2.2.2 NaOH处理时间对猪大肠品质的影响

由图3可知，随着处理时间的增加，得率和蒸煮损失都呈上升趋势，说明处理时间对得率和蒸煮损失都存在显著影响。剪切力和感官评分在20～25 min时分别呈显著下降和上升的趋势，并且感官评分在25 min时达到最大值，之后逐渐下降。说明在25 min时，猪大肠嫩度较好，感官品质最佳。当时间为35 min时，剪切力显著下降，此时感官评分较低。说明此时猪大肠内部结构已经遭到破坏，咀嚼性差。

a-得率和蒸煮损失；b-剪切力和感官评分图3 NaOH处理时间对猪大肠品质的影响Fig.3 Effect of NaOH treatment time on the quality of pig large intestine

2.2.3 NaOH处理温度对猪大肠品质的影响

由图4可知，随着温度的增加，得率呈现先上升后下降的趋势，当温度40 ℃时达到最大值，吸水最多。蒸煮损失在35～40 ℃时，显著下降，说明此时猪大肠持水性较好。剪切力随着温度升高呈现一个先下降后上升的趋势。当温度为40 ℃时，达到最低值。感官评分随着温度的升高呈先上升后下降的趋势。当温度达到40 ℃时，感官评分最高。说明温度为40 ℃时，猪大肠品质最佳。

a-得率和蒸煮损失；b-剪切力和感官评分图4 NaOH处理温度对猪大肠品质的影响Fig.4 Effect of NaOH treatment temperature on pig large intestine quality

2.2.4 木瓜蛋白酶质量分数、处理时间和温度对蒸煮损失和剪切力影响

由图5-a可知，随着木瓜蛋白酶质量分数的增加蒸煮损失和剪切力都呈现先下降后上升的趋势。质量分数达到2%时剪切力达到最小值。木瓜蛋白酶质量分数处于2%～2.2%时蒸煮损失处于最小值且变化不大。根据前人研究，木瓜蛋白酶是一种低特异性巯基酶，它能够将蛋白质分子内部的肽链—CO—NH—分解成多肽和氨基酸[17]。在适宜条件下，可以提高保水性，获得更好的口感。当木瓜蛋白酶添加过量时，剪切力和蒸煮损失都上升。这是因为木瓜蛋白酶过量使用会导致蛋白水解过度，保水性和感官品质下降[18]。如图5-b所示，随着酶处理的时间增加，蒸煮损失和剪切力都呈现先下降后上升的趋势，并且都在100 min时达到最小值。猪大肠嫩化是一定程度的水解，当木瓜蛋白酶处理时间适宜，可以有效降低猪大肠剪切力，提高嫩度。当处理时间超过100 min，猪大肠过度水解，失水老化，嫩度降低[8]。木瓜蛋白酶有最适的反应温度，如图5-c所示，当温度处于25～35 ℃时，猪大肠的剪切力随着温度的升高而逐渐降低，木瓜蛋白酶嫩化效果十分明显；当嫩化温度大于35 ℃时，猪大肠的剪切力反而增加。因此，木瓜蛋白酶处理猪大肠最佳温度为35 ℃，在此温度条件下，猪大肠的嫩化和保水效果较好。

a-木瓜蛋白酶质量分数；b-木瓜蛋白酶处理时间；c-木瓜蛋白酶温度图5 木瓜蛋白酶质量分数、处理时间和温度对蒸煮损失和剪切力影响Fig.5 Effects of papain mass fraction, treatment time and temperature on cooking loss and shear force

2.3 响应面法优化猪大肠的嫩化工艺

2.3.1 响应面分析因素和水平选择

响应面优化猪大肠嫩化工艺试验结果见表4和表5。

表4 感官评分Box-Behnken 试验设计及结果Table 4 The design matrix and result of Box-Behnken experiments (sensory score)

表5 剪切力Box-Behnken 试验设计及结果Table 5 The design matrix and result of Box-Behnken experiments (shear force)

运用Design-Expert.V8.0.6.1软件对表中的数据进行二次多元回归拟合，得到碱处理后感官评分(Y1) 与3个嫩化因子A、B、C的关系如公式(3)所示:

Y1=7.68+0.45A-0.20B+0.25C+0.25AB-0.95AC-0.95BC-0.86A2-0.86B2-0.96C2

(3)

式中：Y1，感官评分；A，NaOH质量浓度；B，碱处理时间；C，碱处理温度。

得到木瓜蛋白酶处理后剪切力(Y2)与3个嫩化因子A、B、C的关系如公式(4)所示：

Y2=11.74-0.13A-0.15B-0.23C+0.022AB-0.16AC-0.030BC+2.03A2+0.29B2+0.71C2

(4)

式中：Y2，剪切力；A，木瓜蛋白酶质量分数；B，时间；C，温度。

回归方程中每项系数绝对值的大小直接反映了各个因素对响应值的影响程度，系数的正负则反映了影响的方向。

2.3.2 多元回归模型分析

表6 感官评分多元回归模型方差分析Table 6 Analysis of variance and multiple regression model on sensory scores

表7 剪切力多元回归模型方差分析Table 7 Analysis of variance and multiple regression model (shear force)

2.3.3 响应面模型中各因素的交互效应分析

应用Design-Expert.V8.0.6.1软件进行响应面分析，各因素对响应值的影响可以用等高线和响应曲面来表示，结果如图6与图7所示。

图6显示了不同NaOH质量浓度(A)、时间(B)、温度(C)对猪大肠感官评分的影响，响应面图为曲面，说明3个因素之间有一定的交互作用，其中AC、BC之间存在极显著交互作用(P<0.001)，AB之间存在高度显著作用(P<0.01)。由图6-a可知，当嫩化时间为24 min左右，NaOH质量浓度为1.1 g/L左右时，猪大肠的感官评分最高，两因素对比，NaOH质量浓度对感官评分影响较大。在适宜NaOH浓度范围内，猪大肠的脂蛋白分解率会随着NaOH质量浓度提高而增加，扩散到猪大肠内部的水分增加，从而增加制成率、增加嫩度。但NaOH质量浓度过高，会使猪大肠吸水过多，猪大肠的内部组织结构遭到破坏，从而保水性、感官品质变差[19]。由图6-b可知，当嫩化温度在41 ℃左右，NaOH质量浓度为1.1 g/L左右时，猪大肠的感官评分最高，且响应曲面的等高线图呈现椭圆形，说明二者之间有显著交互作用。这可能是因为适当浓度的碱液和温度能够使蛋白质溶解暴露亲水基团，提高吸水性和降低剪切力[18, 20-21]。由图6-c可知，当嫩化温度为41 ℃左右，嫩化时间为24 min左右时，猪大肠的感官评分最高。

a-NaOH处理时间和质量浓度；b-NaOH处理温度和质量浓度；c-NaOH处理温度和处理时间图6 各因素的交互效应对感官评分的影响Fig.6 Effect of interaction of various factors on sensory score

a-木瓜蛋白酶处理时间和温度；b-木瓜蛋白酶处理时间和酶用量；c-木瓜蛋白酶处理温度和酶用量图7 各因素的交互效应对剪切力的影响Fig.7 Effect of interaction of various factors on shear force

图7显示了不同木瓜蛋白酶质量(A)、时间(B)、温度(C)对猪大肠感官品分的影响，响应面图为曲面，说明3个因素之间有一定的交互作用，其中AC之间存在显著交互作用(P<0.05)。由图7-a可知，当嫩化时间为102 min左右，嫩化温度为36 ℃左右时，猪大肠的剪切力最低。肌内结缔组织的变化对肉的嫩度影响较大，其中肌束膜和肌内膜中的胶原蛋白起关键作用[22]。随着温度升高到适宜范围，胶原蛋白适当变性，猪大肠的剪切力降低。由图7-b可知，当嫩化时间为102 min左右，酶用量为2.0%左右时，猪大肠的剪切力最高，由图7-c可知，当嫩化温度为36 ℃左右，酶用量为2.0%左右时，猪大肠的剪切力最高。

2.4 验证试验结果

结合回归模型和响应曲面图，得到2种嫩化剂嫩化猪大肠的感官评分和剪切力最佳工艺条件是:以NaOH为嫩化剂时最佳参数组合为NaOH质量浓度为1.08 g/L，时间为24.2 min，温度为40.63 ℃，此时猪大肠的感官评分为7.750。以木瓜蛋白酶为嫩化剂时最佳参数组合为木瓜蛋白酶质量分数为2.01%，时间为101.69 min，温度为36.32 ℃，此时猪大肠的剪切力为11.695 N。

为进一步验证响应面优化的准确性，根据实际操作对最优条件进行调整，在NaOH质量浓度为1.1 g/L，时间为24 min，温度为41 ℃的条件下进行3次验证实验，得到嫩化后的猪大肠感官评分为7.4，与响应面优化的结果相对误差为4.73%，响应面优化结果准确可信。在木瓜蛋白酶质量分数为2.0%，时间为102 min，温度为36 ℃的条件下进行3次验证实验，得到嫩化后的猪大肠剪切力为12.36 N，与响应面优化的结果相对误差为5.38%，响应面优化结果准确可信。

3 结论

NaOH与木瓜蛋白酶来嫩化猪大肠制品，都可以显著增加得率，降低剪切力。以NaOH为嫩化剂时最佳参数组合为NaOH质量浓度为1.1 g/L，时间为24 min，温度为41 ℃，此时猪大肠的感官评分为7.7。以木瓜蛋白酶为嫩化剂时最佳参数组合为木瓜蛋白酶质量分数为2.0%，时间为102 min，温度为36 ℃，此时猪大肠的剪切力为11.70 N。说明这2种嫩化剂对猪大肠的嫩化和品质改善效果较好,有一定实用价值，可以为猪大肠的精深加工提供参考。