李乡南， 杨宇峰， 郭胜男， 张越时， 郭隽馥

(辽宁中医药大学， 沈阳 110847)

胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在各类肿瘤中均居于前5位[1]。早期胃癌发病隐匿，为胃癌的诊断和治疗带来一定困难，故探索胃癌诊疗的新靶标和新途径具有重要意义。

肿瘤干细胞是肿瘤中存在的小部分具有自我更新、自我修复能力、多向分化潜能和放化疗耐药特性的细胞，在肿瘤的发生、增殖、转移、耐药及复发过程中发挥着重要作用[2-5]。肿瘤干细胞独特的干样特性是肿瘤逃逸常规放化疗、导致复发转移的主要原因[6]。近年来，研究报道在肝癌、乳腺癌、胃癌等多种肿瘤中发现肿瘤干细胞[7-9]，其中胃癌干细胞学说为胃癌研究提供了新的思路，成为肿瘤研究和治疗的新方向。

益气健脾法是中医治疗肿瘤的常用方法，四君子汤作为益气健脾法的代表方剂，具有高效、低毒等特点，已成为中医治疗恶性肿瘤研究的热点。临床研究表明，四君子汤加味辅助治疗胃癌可提高化疗疗效，减轻毒副反应[10]。四君子汤联合肠内营养有助于胃癌术后患者肠道功能的恢复，提高机体免疫功能，改善营养状况[11]。本课题组前期研究发现，四君子汤含药血清可有效抑制胃癌细胞的增殖能力并促进其凋亡[12]，沉默S100A4基因表达能够有效抑制胃癌细胞的干样特性[13]。四君子汤对胃癌细胞干样特性的作用尚未见报道。因此，本研究拟进一步探讨四君子汤含药血清对胃癌细胞干样特性的影响及作用机制。本研究通过辽宁中医药大学实验动物伦理委员会审查(批号 21010500092019004)。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠40 只，体质量(280±20) g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，实验动物许可证号SCXK(辽)2015-0 001。饲养于辽宁中医药大学实验动物中心，室温18～23 ℃，相对湿度45%～55%，自由饮水进食，适应性饲养1 周后开始实验。

1.2 药物

人参、白术、茯苓、甘草购于辽宁中医药大学附属医院门诊药局。

1.3 主要试剂与仪器

DMEM培养基(货号SH30243.01B)、DMEM/F12培养基(货号SH30023.01B)，双抗试剂(青霉素和链霉素，美国Hyclone公司，货号JM-SV30010)；胎牛血清(中国依科赛公司，货号FCS500)；CCK-8试剂细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8，CCK-8，货号B34302)、荧光定量PCR试剂盒(美国Bimake公司，货号B21203)；顺铂(山东齐鲁制药公司，国药准字H20023461，20 mg)；TRIzol(货号10296010)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF，货号RP-8661)、成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF，货号PHG0368)及CD44-APC单克隆抗体(美国Invitrogen公司，货号17-0441-81)；B-27补充剂(美国Gibco公司，货号17504044)；低熔点琼脂糖(中国Solarbio(索莱宝公司，货号A8350-100 g/CAS:9012-36-6)；人胃癌SGC7901细胞(目录号TCHu 46)，中国科学院典型培养物保藏委员会)。

T2型倒置显微镜，日本Nikon公司；酶标仪(型号Infinite M200 Pro NanoQuant)，瑞士TECAN公司；QuantStudio 3型实时荧光定量PCR仪，美国ABI公司；CytoFlex型流式细胞仪，美国Beckman coulter公司。

1.4 四君子汤含药血清的制备

采用中药水煎液，将中药饮片先浸泡 30～60 min煎煮3次，将3次煎液混合然后浓缩至含生药2.06 g/mL，过滤并除掉中药渣滓冷藏备用。实验大鼠随机分为四君子低、中、高剂量组和对照组各10只。四君子低、中、高剂量组每日灌胃给予四君子汤煎剂，给药剂量分别为生药0.34 g/100 g、0.69 g/100 g、1.37 g/100 g/体质量，对照组每日灌胃相应0.9%氯化钠溶液，每日1次，共7 d。第7天灌胃给药1.5 h后腹主动脉取血，离心分离血清，56 ℃水浴30 min灭活，0.22 μm微孔滤膜过滤，-80 ℃冷冻保存。

1.5 细胞培养

细胞复苏后培养于含质量分数为1%青霉素-链霉素溶液和体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中孵育。细胞在瓶壁铺满80%时进行传代，选择生长至对数期的细胞用于实验研究。

1.6 细胞增殖实验

实验分为对照组和四君子低、中、高剂量组。取生长状态良好的SGC7901细胞，接种于96孔细胞培养板中，5×103～8×103个/孔，每组3个复孔。12 h～24 h后(融合度达50%～70%)，更换为无血清DMEM培养基饥饿培养。6 h后，各组分别更换为含10%对照组血清和含10%四君子低、中、高剂量组血清的DMEM培养基。分别在加药处理24、48和72 h后弃含药培养基，PBS洗1次，每孔加入含10% 细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8，CCK-8)溶液的DMEM完全培养基，置于细胞培养箱内继续孵育1 h，酶标仪测定450 nm波长OD值，实验重复3次。

1.7 成球实验

实验分为四君子组、顺铂组、四君子+顺铂组和对照组。取生长状态良好的SGC7901细胞接种到6孔细胞培养板中，2×105～3×105个/孔。铺板24 h后(融合度达50%～70%)加药处理，四君子组更换为含10%四君子中剂量组血清的DMEM培养基；顺铂组更换为含4 μg/mL顺铂的DMEM培养基；四君子+顺铂组更换为含10%四君子中剂量组血清和4 μg/mL顺铂的DMEM培养基；对照组更换为含10%对照组血清的DMEM培养基。加药处理48 h后，胰酶消化各组细胞用无血清DMEM/F12培养基[B-27补充剂(1∶50)，0.4%牛血清白蛋白]吹打，调整细胞浓度为1000 个/mL。24孔超低吸附培养板中每孔加入1 mL细胞悬液，每组设立3个复孔，每孔1 mL无血清细胞悬液中所含因子及浓度为：bFGF 20 ng/mL、EGF 20 ng/mL及HEPES 10 mmol/L。常规放入培养箱培养，7 d后显微镜下观察细胞球形成情况。在显微镜下计数3个随机视野且直径大于75 μm的细胞球总数并摄影，实验重复3次。

1.8 软琼脂集落形成实验

加药处理48 h后，准备体积分数为20%胎牛血清DMEM培养基与0.6%的低熔点琼脂糖溶液按1∶1 混合配置上层0.3%软琼脂凝胶，同时各组取3×103个细胞与之充分混匀后注入下层已预加0.5 %软琼脂凝胶的6孔板中，常规放入培养箱培养，7 d后显微镜下观察集落形成情况。在显微镜下计数3个随机视野直径大于50 μm的集落总数并摄影，实验重复3次。

1.9 荧光定量PCR检测

加药48 h后收集细胞，采用TRizol法提取各样本的总RNA、ND5000测定总RNA浓度。逆转录试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板进行扩增(见表1)。反应条件为95 ℃ 5 min预变性，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min共40个循环。以GAPDH为内参，采用2-△△Ct法计算OCT4、SOX2、CD44和S100A4 mRNA相对表达量。

表1 引物序列表

1.10 流式细胞术检测

加药处理48 h 后，采用不含EDTA 的胰酶消化各组细胞收集细胞。PBS 轻洗细胞1次，加入100 μL PBS重悬细胞，再向每份细胞悬液中加入0.06 μg CD44单克隆抗体，混匀后4 ℃避光孵育30 min。PBS 轻洗细胞2次后送检分析，实验重复3次。

1.11 统计学方法

2 结果

2.1 四君子汤含药血清对人胃癌SGC7901细胞增殖能力的影响

图1示，与对照组比较，四君子低、中、高剂量组48 h和72 h细胞的增殖能力均明显下降(P<0.01)，提示四君子汤含药血清可以抑制胃癌细胞增殖。四君子中剂量组48 h和72 h细胞增殖能力均显著低于四君子高剂量组(P<0.01)，72 h细胞增殖能力低于四君子低剂量组(P<0.05)，提示四君子中剂量组抑制胃癌细胞增殖效果最好，故选择四君子中剂量组药物剂量用于后续实验研究。

注： 与对照组比较：**P<0.01；与四君子高剂量组比较：##P<0.01，与四君子低剂量组比较：^P<0.05图1 四君子汤含药血清对人胃癌SGC7901细胞增殖能力的影响

2.2 四君子汤含药血清对人胃癌SGC7901细胞成球能力的影响

图2示，人胃癌SGC-7901细胞在无血清DMEM/F12培养基中逐渐分化成悬浮细胞球，并随培养时间的延长细胞球的数目逐渐增多，体积逐渐增大。四君子组、顺铂组、四君子+顺铂组成球数明显低于对照组(P<0.01)。四君子+顺铂组与顺铂组比较成球数差异无统计学意义。结果提示，四君子汤含药血清处理可以降低胃癌细胞的成球能力。

注：A.各组细胞成球能力代表图片(100×)，培养7d后四君子组、顺铂组、四君子+顺铂组细胞成球数目明显低于对照组；B.平均成球数量(镜下3个随机视野)；与对照组比较：**P<0.01 图2 四君子汤含药血清对人胃癌SGC7901细胞成球能力的影响

2.3 四君子汤含药血清对人胃癌SGC7901细胞集落形成能力的影响

图3示，与对照组比较，四君子组、顺铂组和四君子+顺铂组集落形成数明显减少(P<0.01)，提示四君子汤含药血清可以降低胃癌细胞集落形成能力。

注：A. 各组细胞软琼脂集落形成能力代表图片(40×)，培养7 d后，四君子组、顺铂组、四君子+顺铂组细胞形成集落数目明显低于对照组；B. 平均集落形成数量(镜下3个随机视野)；与对照组比较：**P<0.01 图3 四君子汤含药血清对人胃癌SGC7901细胞集落形成能力的影响

2.4 四君子汤含药血清对人胃癌SGC7901细胞中肿瘤干细胞标志基因OCT4、SOX2和CD44表达的影响

图4示，四君子组、顺铂组和四君子+顺铂组细胞中OCT4、SOX2和CD44 mRNA的表达水平均明显低于对照组(P<0.01)，提示四君子汤含药血清处理能够抑制人胃癌SGC7901细胞中肿瘤干细胞标志基因OCT4、SOX2和CD44的表达。此外，四君子+顺铂组CD44 mRNA的表达水平低于顺铂组(P<0.05)，提示与顺铂组比较，四君子+顺铂组对肿瘤干细胞标志基因CD44表达的抑制作用更强。

注：与对照组比较：**P<0.01；与顺铂组比较：#P<0.05图4 四君子汤含药血清对人胃癌SGC7901细胞中肿瘤干细胞标志基因OCT4、SOX2和CD44 mRNA表达的影响

2.5 四君子汤含药血清对人胃癌SGC7901细胞中CD44+细胞亚群的影响

图5示，与对照组比较，四君子组、顺铂组和四君子+顺铂组CD44+细胞比例明显降低(P<0.01)，提示使用四君子汤含药血清处理可以降低胃癌细胞中CD44+细胞亚群比例。

注：A.流式细胞术检测CD44+细胞亚群；B.各组细胞中CD44+细胞亚群的比例；与对照组比较：**P<0.01图5 四君子汤含药血清对人胃癌SGC7901细胞中CD44+细胞亚群的影响

2.6 四君子汤含药血清对人胃癌SGC7901细胞中S100A4表达的影响

图6示，四君子组、顺铂组和四君子+顺铂组细胞中S100A4 mRNA的表达水平明显低于对照组(P<0.05)，提示四君子汤含药血清处理能够降低人胃癌SGC7901细胞中S100A4基因的表达。

注：与对照组比较：*P<0.05 图6 四君子汤含药血清对人胃癌SGC7901细胞中S100A4 mRNA表达的影响

3 讨论

目前诸多医家认为，脾胃虚弱是胃癌发病的主要因素，兼有气虚、阴虚、血瘀、气滞、痰浊和湿邪等其他致病因素，因此治疗应“从脾论治”，健脾助运，气机流利，以充元气则能驱癌毒外出[14]。四君子汤是益气健脾的代表方剂，方中人参为君，甘温益气，健脾养胃；臣以苦温之白术健脾燥湿，加强益气助运之力；佐以甘淡茯苓健脾渗湿，苓术相配则健脾祛湿之功益著；使以炙甘草益气和中，调和诸药[15，16]。现代药理学研究发现，四君子汤具有抑制肿瘤生长和血管生成的作用，并且在影响肿瘤细胞增殖、侵袭、凋亡等方面都发挥着重要作用[12,17-22]。本研究利用四君子汤制备含药血清，对人胃癌SGC7901细胞进行干预处理，通过观察其对胃癌细胞干样特性的影响，探讨其治疗胃癌的潜在机制。

肿瘤干细胞是导致肿瘤复发和转移的重要原因，具有先天耐药性。目前，肿瘤干细胞已成为肿瘤治疗的重要靶向细胞，对靶点进行干预以治疗肿瘤成为新的研究方向之一。成球以及软琼脂集落形成实验是研究肿瘤干样特性的主要体外研究方法，用于证实肿瘤细胞的自我更新能力。本研究结果发现，四君子汤含药血清可以明显降低胃癌细胞的成球和集落形成能力，提示其具有抑制胃癌细胞干样特性的作用。OCT4、SOX2和CD44是肿瘤干细胞标志基因[23，24]。本研究采用荧光定量PCR法检测上述3个基因mRNA水平，发现四君子汤含药血清能够显著降低其表达，且与顺铂组比较，CD44在四君子+顺铂组中的表达水平明显更低，提示顺铂与四君子联用对胃癌细胞干样特性的抑制效果更为显著。此外，鉴于CD44+是胃癌干细胞表面典型的标志分子[25]，本研究采用流式细胞术分析了CD44+细胞亚群在胃癌细胞中的比例，发现在四君子汤含药血清的作用下CD44+细胞亚群比例显著降低，进一步证实四君子汤对胃癌细胞干样特性的抑制作用。

S100A4是钙离子结合蛋白S100家族的成员之一，是一种具有多向调节功能的转录因子，在多种肿瘤组织中均呈高表达，且与肿瘤转移、术后复发及患者预后不良密切相关[26-29]。研究人员现已证实，S100A4高表达与胃癌浸润、淋巴结转移等密切相关[30，31]。抑制S100A4基因表达后，胃癌细胞凋亡增加、增殖力及裸鼠成瘤能力均显著降低[32]。课题组前期研究并报道了S100A4能够与GDF15基因启动子区域结合，进而对其转录起正向调控作用。GDF15可介导S100A4对胃癌细胞干样特性的促进作用[33]。Yu等[34]研究发现，下调S100A4可以有效降低胃癌细胞中SOX2的表达，提示S100A4可能通过影响下游靶基因的表达进而影响胃癌细胞的干样特性。本研究发现，经四君子汤含药血清处理后胃癌细胞中S100A4 mRNA的表达水平显著降低，提示四君子汤可能通过抑制S100A4的表达，进而降低多种促癌基因表达，从而抑制胃癌细胞的干样特性，具体机制有待进一步研究。

综上所述，四君子汤含药血清能够有效降低胃癌细胞的成球力、软琼脂集落形成能力、肿瘤干细胞标志基因表达及CD44+细胞亚群比例，抑制胃癌细胞的干样特性，其上述作用可能是由S100A4介导实现的。这可能成为四君子汤治疗肿瘤的潜在作用机制之一。