杨明强，曾珊珊，林鑫，刘浩，陈丹扬

(广州医科大学附属肿瘤医院肿瘤研究所，广东 广州 510095)

三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)约占所有乳腺癌的10%～15%，其特征是缺乏雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)和 人表皮生长因子2 受体(human epidermal growth factor 2 receptor，HER-2)的表达[1]。TNBC以浸润性导管癌为主，细胞增殖活性和组织分级均显著升高，恶性程度高，预后较差，复发率高且易发生远处转移[2-3]。目前，化疗是唯一治疗早期和晚期TNBC较为成熟的方法。由于其高侵袭的特性以及靶向治疗方式的缺乏，TNBC的基础与临床研究仍持续进行着，以期提高治疗效果，改善患者的临床预后。

Wolf-Hirschhorn 综合征候选基因1(Wolf-Hirschhorn syndrome candidate gene-1，WHSC1)，也被称为核受体结合SET结构域蛋白(nuclear receptor binding SET domain-protein，NSD)或多发性骨髓瘤集合域(MMSET)，是含有SET结构域的组蛋白赖氨酸甲基转移酶家族的成员，在早期生长和发育中发挥重要作用[4]。WHSC1能够催化组蛋白H3赖氨酸第36号位(H3K36)的二甲基化(H3K36me2)，进而影响基因转录[5]。越来越多的研究表明，WHSC1在多种恶性肿瘤中高表达[6-8]，并与某些肿瘤的侵袭转移、化疗抵抗和不良预后等相关[9-12]。尽管已知WHSC1在乳腺癌中表达异常[13]，但其在TNBC中的作用及分子机制尚未被阐明，亟需进一步深入研究。

本研究拟通过生物信息学分析WHSC1在TNBC组织中的表达，从体外和体内水平检测其对TNBC细胞增殖的影响，初步探讨WHSC1调控TNBC细胞增殖的潜在分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

细胞培养基、胎牛血清、胰酶等购自美国Gibco公司，蛋白酶抑制剂PMSF购自美国Sigma公司，RIPA裂解液购自碧云天生物技术公司，ECL化学发光底物试剂盒购自美国Thermo公司，WHSC1、Ki-67、p21、GAPDH、β-Tublin蛋白一抗，HRP标记山羊抗鼠IgG、山羊抗兔 IgG购自美国CST公司，免疫显色试剂购自福州迈新生物技术开发有限公司，BALB/c裸鼠购自广东省实验动物中心，动物实验通过广州医科大学实验动物伦理委员会伦理审查。

1.2 细胞培养

人三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231、BT549均来自广州医科大学附属肿瘤医院肿瘤研究所。MDA-MB-231、BT549细胞用含10% FBS的RPMI 1640培养基，于37 ℃、5% CO2培养箱内培养。1～2 d换液，每3～4 d传代1次，实验时选用对数生长期的细胞。

1.3 WHSC1稳定过表达细胞系的筛选

pCMV-WHSC1过表达质粒购自美国Origene公司。取对数生长期的细胞，接种于6孔板中，37 ℃、5% CO2的培养箱中培养过夜。根据Lipofectamine 2000转染试剂说明书，将相应的质粒转染至细胞中。培养48 h后，采用嘌呤霉素筛选稳定过表达WHSC1的细胞株。

1.4 qRT-PCR分析

利用Trizol试剂提取细胞总RNA，按Primescript RT reagent Kit反转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA，Real-time PCR反应体系及条件参照 SYBR Premix Ex TapTM试剂盒(TaKaRa)，2-△△CT法计算mRNA的相对表达量，以GAPDH作为内参。每个实验组重复3次。WHSC1上游引物序列：5′-TGTGTGAGCTGCCATGCTTCCA-3′，下游引物序列：5′-TGAGCATCCTGCTGCCAGACAA-3′；GAPDH上游引物序列：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物序列：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。

1.5 MTS法检测细胞增殖

用0.25%胰酶消化对数生长期的细胞，细胞计数并以3 000个/孔的细胞数接种于96孔培养板中。细胞贴壁后，分别培养24、48、72 h，加入MTS试剂(20 μL/孔)，培养箱中孵育2.5 h，酶标仪检测490 nm处的吸光值。以细胞贴壁后加入MTS的时间为横坐标、吸光值为纵坐标作图并拟合曲线。每组浓度设4个复孔。

1.6 Western blotting分析

收集过表达WHSC1的TNBC细胞及对照组细胞，用含PMSF的RIPA裂解液裂解细胞，离心后收集上清，BCA法测定蛋白质浓度。等量蛋白质样品经10%的SDS-PAGE分离后，转印至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，WHSC1、p21、GAPDH、β-tubulin蛋白一抗均以1∶1 000比例稀释，4 ℃ 孵育过夜。经PBST洗涤后，加入按1∶5 000比例稀释的HRP标记的特异性二抗，室温下孵育2 h，最后加入ECL化学发光试剂于Tanon成像系统拍照。

1.7 克隆形成实验

用0.25%胰酶消化对数生长期的细胞，细胞计数并按1 000个/孔的细胞数接种于6孔板中，37 ℃、5% CO2的培养箱内培养过夜。每隔3 d换液，培养1周后用预冷PBS洗涤细胞，加入甲醇固定细胞10 min，0.1%结晶紫染色15 min，水中漂洗干净，晾干后拍照，用Image J进行分析。

1.8 裸鼠皮下成瘤实验

将过表达WHSC1的MDA-MB-231细胞及对照细胞培养至对数生长期，胰酶消化并离心，无菌PBS洗涤2次，配置成浓度为5×107/mL的细胞悬液。选取4周龄的BALB/c雌性裸鼠，分成实验组和对照组，每组6只，将细胞充分混匀接种于裸鼠腋窝中后部，每只接种体积为0.1 mL。接种细胞5天后，游标卡尺测量并记录瘤体最大横径(a)及最大长径(b)，每隔3天测量1次，计算肿瘤体积V=1/2×a×b2；3周后，处死裸鼠，剥离出肿瘤组织并拍照；肿瘤组织固定于10%福尔马林中，以备组织学使用。

1.9 免疫组织化学分析

组织切片经环保透明剂脱蜡后梯度乙醇脱水，PBS洗涤；将切片放入0.01 M枸橼酸钠缓冲液，进行高压抗原修复，PBS洗涤；滴加内源性过氧化物酶阻断剂A孵育10 min，PBS洗涤；滴加非特异染色阻断剂B孵育10 min，PBS洗涤；滴加稀释后的一抗Ki-67(1∶100)，4 ℃孵育过夜；PBS洗涤后，滴加二抗室温孵育1 h；PBS洗涤后DAB显色、苏木素复染、盐酸酒精分化；脱水、透明、封片后显微镜下观察Ki-67的表达情况。

1.10 统计分析

应用GraphPad Prism 7.0软件分析处理数据。计量资料以均数±标准差表示，两组比较采用两独立样本t检验，P<0.05差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 WHSC1在三阴性乳腺癌组织中的表达

在线癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库分析显示WHSC1在1 097例乳腺癌组织中的表达显著高于141例正常乳腺组织(P<0.001)(见图1A)。进一步分析WHSC1在不同亚型的乳腺癌组织中的表达情况，结果显示WHSC1在TNBC组织中的表达显著高于Luminal型乳腺癌组织(P<0.01)及HER2+型乳腺癌组织(P<0.001)(见图1B)。

注：A：TCGA数据库分析WHSC1在乳腺癌组织中的表达；B：TCGA数据库分析WHSC1在不同亚型的乳腺癌组织中的表达；**P<0.01，***P<0.001

2.2 体外实验考察过表达WHSC1对三阴性乳腺癌细胞增殖的影响

为考察WHSC1对TNBC细胞的增殖影响，采用pCMV-WHSC1质粒转染MDA-MB-231和BT549细胞，构建稳定过表达WHSC1的细胞株及对照组细胞株。如图2A和2B所示，qRT-PCR及Western blotting验证，过表达WHSC1的MDA-MB-231和BT549细胞构建成功。接着，MTS实验结果显示，与对照组相比，过表达WHSC1可明显提高MDA-MB-231和BT549细胞的增殖能力(见图2C和2D)。克隆形成实验发现，过表达WHSC1的MDA-MB-231细胞克隆数为对照组的4.89±1.35倍(P<0.001)，过表达WHSC1的BT549细胞克隆数为对照组的5.70±0.88倍(P<0.001)，说明过表达WHSC1显著增强MDA-MB-231和BT549细胞的克隆形成能力(见图2E和2F)。

注：A：qRT-PCR检测稳定过表达WHSC1的MDA-MB-231和BT549细胞中WHSC1的mRNA表达水平；B：Western blotting检测稳定过表达WHSC1的MDA-MB-231和BT549细胞中WHSC1的蛋白表达水平；C：MTS检测稳定过表达WHSC1的MDA-MB-231细胞的增殖能力；D：MTS检测稳定过表达WHSC1的BT549细胞的增殖能力；E：克隆形成实验检测稳定过表达WHSC1的MDA-MB-231和BT549细胞的克隆形成能力；F：柱状图分析实验组和对照组细胞的克隆形成数量;**P<0.01，***P<0.001

2.3 体内实验考察过表达WHSC1对三阴性乳腺癌增殖的影响

WHSC1在体外水平对TNBC细胞增殖具有促进作用，为验证其在体内是否具有同样的功能，本组分别将稳定过表达WHSC1的MDA-MB-231细胞及对照细胞在裸鼠皮下接种，每隔3天测量并记录裸鼠肿瘤生长情况，并绘制生长曲线。图3A-D结果显示，过表达WHSC1组的裸鼠肿瘤体积为(759.29±188.25)mm3，明显大于对照组的肿瘤体积(105.41±79.10)mm3(P<0.01)；过表达WHSC1组的移植瘤重量(0.51±0.15)g较对照组(0.05±0.04)g明显增加(P<0.01)，说明过表达WHSC1能够显著促进裸鼠移植瘤的生长。接着，采用免疫组化实验分析移植瘤组织中增殖标志物Ki-67的表达情况。结果如图3E所示，过表达WHSC1组的Ki-67表达水平较对照组明显上调。上述结果表明，过表达WHSC1增强TNBC细胞在体内的增殖能力。

注：A：稳定过表达WHSC1的MDA-MB-231细胞及对照细胞在裸鼠皮下成瘤及生长情况；B：3周后，处死裸鼠，剥离出肿瘤组织并拍照；C：以时间为横坐标、肿瘤体积为纵坐标绘制肿瘤生长曲线图；D：对肿瘤组织进行称重并作图分析；E：免疫组化检测裸鼠肿瘤组织中Ki-67的表达情况;**P<0.01，***P<0.001

2.4 WHSC1对三阴性乳腺癌细胞增殖相关蛋白的影响

进一步采用Western blotting检测过表达WHSC1对TNBC细胞增殖相关蛋白的影响。结果如图4所示，与对照组相比，过表达WHSC1的MDA-MB-231细胞c-Myc和CDK4蛋白表达升高(P<0.01)，而p21蛋白表达下调(P<0.001)。

注：A：Western blotting检测过表达WHSC1前后MDA-MB-231细胞中c-Myc、CDK4和p21蛋白的表达变化；B：c-Myc、CDK4和p21蛋白表达的灰度分析;**P<0.01，***P<0.001

3 讨 论

三阴性乳腺癌是乳腺癌中恶性程度最高的亚型之一，因其ER、PR和HER-2表达的缺乏，传统的放疗及化疗往往不能得到满意的效果。大多数TNBC患者化疗后复发，预后不佳，主要原因是缺乏有效的靶向治疗[14]，因此发现新的分子标志物或治疗靶标，对于TNBC的诊断及治疗具有重要意义。

越来越多研究也指出，WHSC1在多种恶性肿瘤中表达显著增高[6-8]。Wu等[8]研究发现WHSC1通过激活mTORC1信号促进肝癌细胞增殖、迁移和侵袭。Kojima等[15]研究表明WHSC1受EZH2调控，对卵巢癌细胞的增殖起重要作用。然而，WHSC1在TNBC中的作用尚未阐明。本研究中，前期通过TCGA数据库分析发现，WHSC1在TNBC组织中显著高表达；采用MTS及克隆形成实验检测，从体外水平上说明过表达WHSC1可增强TNBC细胞的增殖能力；构建裸鼠皮下成瘤模型从体内水平验证，过表达WHSC1可增强TNBC细胞的增殖。

组蛋白甲基化修饰是一种重要的表观遗传修饰方式，该甲基化过程发生在组蛋白赖氨酸或精氨酸残基上。组蛋白甲基化的异常可特异性地激活或抑制某些基因的转录活性，其功能失调往往与肿瘤的发生与发展相关[16]。在修饰组蛋白的酶中，组蛋白甲基转移酶是极具潜力的癌症治疗靶点[17-18]。WHSC1作为一种组蛋白赖氨酸甲基转移酶，包含具有催化活性的SET结构域，以核小体(组蛋白与DNA的复合体)为底物催化组蛋白的甲基化[19]。由于WHSC1能够引起细胞中H3K36me2水平增高从而影响基因的转录[5]，因此WHSC1的高表达可能通过H3K36me2介导的染色体可及性变化来促进细胞增殖。本研究中，过表达WHSC1的MDA-MB-231细胞中，c-Myc的蛋白表达量较对照组明显升高(P<0.01)。c-Myc是一个致癌驱动因子，能够促进多种肿瘤的恶性转化[20]。有研究报道，敲低WHSC1能够显著降低c-Myc启动子区的H3K36me2水平，导致该基因的转录受到抑制[21]。这提示，WHSC1可能发挥其甲基转移酶的功能，上调c-Myc的转录进而影响下游各类基因表达，刺激肿瘤细胞代谢和增殖。另外，c-Myc在转录水平上能够抑制p21蛋白的表达。p21蛋白是一种细胞周期蛋白-细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-CDK)的抑制剂，能够抑制所有的cyclin-CDK复合物[22]；p21已被证明能够抑制结合了Cyclin D1和Cyclin D2 的CDK4[23]。作为细胞周期的负调控因子，p21丢失会促进恶性肿瘤的发生及进展。本研究发现过表达WHSC1的MDA-MB-231细胞中p21蛋白表达降低，CDK4蛋白表达升高(图4，P<0.01)，意味着细胞周期进程加快，进而促进TNBC细胞的增殖。

综上所述，WHSC1在TNBC中高表达，WHSC1能够促进TNBC细胞的增殖能力，其分子机制有待进一步的研究。