郭 路 刘晓 程 顾 超 李 斌△

（1复旦大学附属妇产科医院妇科 上海 200011；2上海市女性生殖内分泌相关疾病重点实验室 上海 200090）

随着女性生育时间的延迟以及三孩政策的开放，生育力保存及卵巢功能保护越来越受到女性关注。 早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）病因复杂，约50%以上的患者病因不明确，近年来研究发现氧化应激在始基卵泡形成、卵泡发育、成熟、闭锁等多个环节中均发挥作用，可能对卵巢储备功能维持具有重要影响［1］。研究表明，组蛋白去乙酰化酶（Sirtuin1，SIRT1）参与调节细胞应激、衰老等多个生理病理过程［2］。SIRT1 可通过激活PI3K/AKT/mTOR 通路减少POI 大鼠模型颗粒细胞氧化应激，抑制细胞凋亡，参与调控始基卵泡募集过程［3-4］。本课题组前期研究发现POI 患者血清氧化水平升高，抗氧化水平降低，并且SIRT1 含量及活性降低。因此，我们推测氧化应激可能通过SIRT1 影响颗粒细胞发育及功能，进 而 参 与POI 发 生，但 其 具 体 机 制 不 详［5］。SIRT1 特异激动剂白藜芦醇（resveratrol，Res）预处理可以改善环磷酰胺所致大鼠卵巢颗粒细胞损伤，而SIRT1 选择性抑制剂EX527 可以逆转Res 的保护作用，表明SIRT1 可能是Res 作用的重要中介［6］。而Res 在卵母细胞减数分裂过程中可以上调胞质环腺甘酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP），激活Epac1/CaMKKβ/AMPK/SIRT1/PGC-1α 通 路，进而促进脂肪酸氧化、线粒体呼吸等生理活动［7-9］。但Res 对氧化应激诱导POI 的改善作用及机制尚不清楚。

因此，本研究拟从细胞水平检测Res 对氧化应激损伤人黄素化颗粒细胞功能作用，并从体内实验验证Res 对氧化应激损伤POI 模型小鼠卵巢作用，最后探索SIRT1-cAMP 通路是否参与其作用过程，寻找POI 潜在致病机制及可能治疗方向。

资料和方法

人原代颗粒细胞培养2019 年11 月至2020 年5月于上海集爱遗传与不孕诊疗中心收集人原代颗粒细胞15 例，并经过复旦大学附属妇产科医院伦理委员会批准（批准号：2019-47）。入选标准：（1）在诊疗中心就诊的女性患者，年龄＜40岁，未绝经，平素月经规律，经量正常，血FSH 水平、AMH 水平正常。（2）无化疗、放疗、自身免疫性疾病、卵巢原发或转移肿瘤、盆腔及卵巢炎症性疾病、盆腔或卵巢手术史。（3）无生殖相关家族病史，母亲月经规律且停经年龄≥40 岁，若有子女，则子女青春期正常发育、月经规律。（4）行第二代试管婴儿，即卵胞浆内单精子显微注射技术（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）。

将含有卵泡液的颗粒细胞移入刻度离心管，223.8×g离心5 min，弃去上清液。沉淀中加入3 倍体积的红细胞裂解液，混匀，静置3 min，223.8×g离心5 min，沉淀中加入15%胎牛血清的DMEM/F12不含酚红培养基，接种于6 孔板中。

细胞实验分组及处理实验前1 天颗粒细胞6 孔板铺板（5×105/孔），随机分为3 组：H2O2组，H2O2+Res组和正常对照组，分别予100 μmol/L H2O2，10 μmol/L Res+100 μmol/L H2O2培养液干预24 h。

动物实验分组及处理6 周龄雌性SPF 级C57小鼠（上海捷思杰公司），共24 只，均经阴道涂片筛查，性周期正常，适应性喂养1 周。随机分为对照组、3-NPA 组［10］、3-NPA+Res 组 及Res 组，每 组6只。对照组小鼠第1～3 天予0.5%甲基纤维素灌胃，第4～24 天予0.5%甲基纤维素灌胃+生理盐水腹腔注射；3-NPA 组小鼠第1～3 天予0.5%甲基纤维素灌胃，第4～24 天予0.5% 甲基纤维素灌胃+40 mg/kg 3-NPA 腹腔注射；3-NPA+Res 组第1～3天 予40 mg/kg Res 灌 胃，第4～24 天 予40 mg/kg Res 灌胃+40 mg/kg 3-NPA 腹腔注射；Res 组第1～3天 予40 mg/kg Res 灌 胃，第4～24 天 予40 mg/kg Res 灌胃+等量生理盐水腹腔注射［11］；从动情周期、卵巢指数、卵泡计数及激素水平评估小鼠卵巢功能［12］。每天早10 时行阴道分泌物涂片，观察动情周期。每周称量体重，于停药后处死。小鼠双侧卵巢称重并计算卵巢指数。卵巢指数=卵巢重量（mg）/小鼠体质量（g）×100%。

检测指标与方法（1）细胞凋亡检测：胰酶消化，4 ℃223.8×g离心5 min，加入5 μL 的Annexin VPE 及5 μL 7-AAD，避光孵育15 min，使用流式细胞仪检测细胞凋亡。（2）线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）检测：加入罗丹明123 染液10 g/mL，37 ℃细胞培养箱孵育30 min，流式细胞仪检测MMP 水平。（3）E2、FSH 及AMH 检测：收集细胞上清液或血清，4 ℃223.8×g离心10 min，取上清，ELISA 检测E2（25～2 000 pg/mL）、FSH（4～140 U/L）及AMH（0.156～10 ng/mL）浓度。（4）颗粒细胞免疫荧光FSHR 检测：1×105/mL 颗粒细胞爬片，PBS 冲洗3 次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS冲洗3 次，0.5%Triton X-100 室温通透20 min，PBS冲洗3 次，室温封闭60 min，FSHR 抗体（1∶500）4 ℃湿盒孵育过夜。PBS 冲洗3 次，荧光二抗室温敷育60 min，DAPI 避光敷育5 min，PBS 冲洗，在共聚焦显微镜下观察并拍照。

实时定量荧光聚合酶链反应（RT-PCR）Trizol冰上裂解细胞或组织15 min，提取RNA，配置逆转录体系，应用Prime Script™RT Master Mix 逆转录试剂盒，37 ℃15 min，80 ℃5 s，4 ℃10 min 曲线扩增，收集cDNA。应用SYBR Premix Ex Taq PCR试剂盒，配置扩增体系，每孔10 μL。每个样品设置3 复孔，384 孔板上样，利用荧光定量PCR 仪扩增，设置扩增及溶解曲线，2-ΔΔCT用于作图及计算统计学差异。

Western blot 法检测卵巢组织或细胞中SIRT1、AMHR2、FSHR、LHR、SOD2、GSH-Px、MDA5 表达制备蛋白样品，BCA 检测蛋白浓度，30 μg 蛋白样品上样，60 V 电压跑浓缩胶，120 V 分离胶电泳。330 mA 恒电流转膜90 min，冰水混合物降温。牛奶封闭60 min，一抗稀释液SIRT1（1∶2 000）、FSHR（1∶2 000）、AMHR2（1∶2 000）、LHR（1∶2 000）、SOD2（1∶1 000）、MDA5（4 μg/mL）、GSH-Px（1 μg/mL），GAPDH（1∶2 000）4 ℃孵育过夜。第二天室温摇床孵育二抗60 min，应用ECL 超敏发光液试剂盒配置发光液，放入发光仪曝光条带。

统计学分析所有实验均重复3 次。所有数据用±s表示，采用GraphPad Prism 6.0 软件分析，两组间比较用独立样本t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

SIRT1 激动剂Res 可改善氧化应激导致的颗粒细胞损伤免疫荧光检测显示人黄素化颗粒细胞表达颗粒细胞特异性受体FSHR。通过H2O2诱导氧化应激损伤颗粒细胞模型，发现H2O2组线粒体膜电位降低，细胞凋亡显著增加，成功建立氧化应激损伤颗粒细胞模型。Res+H2O2干预组细胞线粒体膜电位增加，细胞凋亡显著减少。此外，Res+H2O2干预组抗氧化指标SOD2及GSH-Px 表达明显升高，氧化指标MDA5 表达降低，颗粒细胞表面功能性受体FSHR、LHR 表达部分增加，雌激素合成能力增加，雌激素合成及调控基因CYP19A1、CYP17A1、AR、NR5A1、STAR以及颗粒细胞功能受体基因FSHR、LHR、AMHR2、ESR1、ESR2mRNA 水平均显著升高。以上结果表明Res 可能通过激活SIRT1增加颗粒细胞激素合成能力及其表面受体表达，改善氧化应激导致的颗粒细胞损伤（图1、2）。

图1 Res 抑制氧化应激损伤颗粒细胞凋亡Fig 1 Resveratrol inhibits the apoptosis of oxidative-stress injured granulosa cells

Res 可以改善POI 小鼠卵巢功能4 组小鼠体重未见显著差异，3-NPA 组小鼠平均动情间期延长，平均动情期缩短，卵巢指数下降，血清FSH 水平升高，AMH 水平降低，始基卵泡数量降低，与POI 表型相似。而3-NPA+Res 组平均动情间期缩短，平均动情期延长，卵巢指数上升，血清FSH 水平降低，AMH 水平升高，始基卵泡数量增加，说明Res 具有改善小鼠POI 表型的作用。进一步检测发 现，3-NPA 组 小 鼠 血 清SOD、GSH-Px 活 性 降低，MDA 活性升高，而3-NPA+Res 组小鼠血清SOD、GSH-Px 活性升高，MDA 活性降低。以上结果表明SIRT1 激动剂Res 具有改善小鼠POI 表型的作用（图3）。

图3 Res 对小鼠POI 表型的作用Fig 3 Effect of resveratrol on POI phenotype of mice

SIRT1-cAMP 信号通路可能参与Res 改善氧化应激POI 小鼠卵巢功能过程通过PCR 检测对照组、3-NPA 组、3-NPA+Res 组、Res 组小鼠卵巢组织中cAMP 信号通路关键基因，结果发现3-NPA 组小鼠 卵 巢 组 织EPAC、RAP1a、RAP1b、PLCb3、CREB1、CAMK2α及SIRT1基因表达降低，SIRT1活性降低，说明cAMP 信号通路可能参与氧化应激POI 小鼠的发生，而3-NPA+Res 组卵巢组织中EPAC、RAP1a、RAP1b、PLCb3、CREB1、CAMK2α及SIRT1基因表达升高，以上结果进一步说明cAMP-EPAC-Rap-CAMK 信号通路可能参与氧化应激POI小鼠的发生，Res通过激活cAMP-EPAC-Rap-CAMK 信号通路改善小鼠POI表型作用，cAMP信号通路与SIRT1之间可能存在正反馈作用（图4）。

图4 cAMP 信号通路参与氧化应激POI 小鼠发生Fig 4 The cAMP signaling was involved in oxidative-stress induced POI mice

讨 论

POI 发病率逐年增加，卵巢功能下降所带来的一系列低雌激素症状严重影响女性身心健康和生活质量。POI 病因复杂，其发生机制更是不详。氧化应激在POI 疾病中的作用目前已得到认可，POI患者血清抗氧化活性降低，氧化活性升高［13-14］。氧化应激通过抑制卵细胞成熟，促进细胞凋亡，诱导或加速POI 发生［15-16］。

图2 Res 可以改善氧化应激损伤颗粒细胞功能Fig 2 Resveratrol can improve function of oxidative-stress damaged granulosa cells

近年来，多项研究提示SIRT1 参与氧化应激过程［17-18］。SIRT1 激活可以促进PI3K-AKT 通路介导的FOXO1 去乙酰化修饰，抑制氧化应激诱导的卵巢颗粒细胞自噬［19］。白藜芦醇（Res）是SIRT1 特异激动剂，实验结果提示Res 具有改善氧化应激损伤颗粒细胞及POI 小鼠卵巢功能，进一步说明Res 可以通过激活SIRT1 改善POI 小鼠低雌激素状态。

cAMP 是细胞内参与调节物质代谢和生物学功能的重要物质，是细胞内信号传导过程中的“第二信使”。cAMP 贯穿卵泡发育全过程，卵泡细胞内高水平的cAMP 维持卵母细胞处于减数分裂静止期［20］。Res 可以增强cAMP 信号，在黄素化人颗粒细胞中，cAMP 与SIRT1 表达之间的正反馈机制维持SIRT1 在高水平状态［21-22］。cAMP 信号通过激活SIRT1 改善阿霉素诱导的氧化应激损伤、细胞凋亡及心肌毒性［23］。本研究发 现3-NPA 组cAMP 信号通 路 关 键 基 因EPAC、RAP1b、RAP1a、PLCb3、CREB1、CAMK2α及SIRT1基因表达降低，SIRT1活性降低，而3-NPA+Res 组小鼠卵巢组织EPAC、RAP1b、RAP1a、PLCb3、CREB1、CAMK2α及SIRT1基因表达升高，SIRT1 活性升高，以上结果进一步说明cAMP 信号通路参与氧化应激POI 的发生，Res 可以增强cAMP 信号通路关键基因表达，两者之间可能存在正反馈机制。

综上所述，Res 可以通过SIRT1-cAMP 通路抗氧化作用改善POI 表型，本研究有助于寻找POI 治疗潜在靶点，改善POI 患者低雌激素状态及维持卵泡发育及功能。但是本实验存在一定的局限性，首先，氧化应激细胞模型采用H2O2，以动物模型是3-NPA，后续应该增加3-NPA 细胞实验以保持一致性；其次，近年来的研究发现Res 在激活SIRT1 的同时，SIRT3 也参与起调控作用，后续实验须进一步排除SIRT3 的干扰；最后，本文机制研究较浅，SIRT1 与cAMP 信号通路之间的具体调控机制尚不清楚，仍需后续的实验研究来阐明。

作者贡献声明郭路 文献调研与整理，实验操作，图表绘制，论文撰写。刘晓程 PCR 实验及数据统计和分析，图表绘制。顾超 实验监督与指导，可行性分析，论文修订。李斌 课题构思与设计，数据分析与解释，论文修订。

利益冲突声明所有作者均声明不存在利益冲突。