张泽麟, 嵇 杰, 徐文雨, 刘 卓, 范晓春, 邓昌鑫, 何倩毓

(黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院, 黑龙江大庆 163319)

保幼激素(juvenile hormone, JH)是主要由昆虫咽侧体分泌的倍半萜烯类激素，调控昆虫的生长、变态和生殖等重要生理过程。昆虫体内JH的滴度水平主要是由JH的合成速率决定。JH的生物合成是由一系列的酶促反应组成，以JHⅢ为例，总共包括13个反应，通常被分为早期和晚期两大步骤(Nouzovaetal., 2011)。早期步骤是经典的甲羟戊酸(mevalonic acid, MVA)通路，这一通路主要是由乙酰辅酶A到法尼焦磷酸(farnesyl pyrophosphate, FPP)的合成过程中的 8个反应所组成(Bellésetal., 2005)。目前已知，该途径中的中间产物和催化酶在真核生物中是高度保守的(Nouzovaetal., 2018)。JHⅢ合成的后期步骤则是由剩下的5个反应所组成，即从FPP到JHⅢ，这一过程是昆虫所独有(Goodman and Cusson, 2012)。研究表明，绝大多数与JH合成相关的酶主要富集及表达于昆虫咽侧体组织中，并且它们的表达模式与昆虫体内的JH滴度水平呈正相关(Kinjohetal., 2007; Chengetal., 2014; Rivera-Perezetal., 2014)。其中由保幼激素酸甲基转移酶(juvenile hormone acid methyl transferase, JHAMT)催化的甲基化反应是JH晚期合成过程中的限速步骤，因此，JHAMT也成为JH合成中的关键调控酶。Shinoda 和 Itoyama (2003)在家蚕Bombyximori中克隆得到首个JHAMT基因，之后相继在黑腹果蝇Drosophilamelanogaster(Niwaetal., 2008)、赤拟谷盗Triboliumcastaneum(Minakuchietal., 2008)、埃及伊蚊Aedesaegypti(Mayoraletal., 2009)、西方蜜蜂Apismellifera(Lietal., 2013)以及德国小蠊Blattellagermanica(Dominguez and Maestro, 2018)等昆虫中获得相应的JHAMT基因。大量研究发现，RNAi降低JHAMT基因的表达或突变JHAMT均可导致昆虫体内JH滴度下降以及JH信号减弱，产生类似于JH缺失的各种表型(Minakuchietal., 2008; Niwaetal., 2008; Daimonetal., 2015; Wenetal., 2015; Dominguez and Maestro, 2018)。因此，通过干扰昆虫体内JHAMT的表达来抑制JH的生理功能可成为农林业中害虫防治的一种潜在手段(Guoetal., 2018)。

近年来，在果蝇、家蚕、烟草天蛾Manducasexta、德国小蠊、飞蝗Locustamigratoria等多种昆虫中的研究发现，昆虫变态发育除受内分泌激素调控外，microRNA(miRNA)也参与其中。大量研究表明，miRNA通过靶向作用于蜕皮激素(20-hydroxyecdysone, 20E)信号通路的重要组分基因而参与20E对昆虫变态发育的调控。如 Ling等(2014)在家蚕中的研究发现，利用miR-Sponge技术拮抗let-7的功能，可导致幼虫蜕皮或幼虫-蛹变态过程中出现发育停滞。let-7对家蚕蜕皮和变态的调控被证明是通过抑制20E信号通路中FTZ-F1和E74的表达来实现的。 德国小蠊的研究中发现，let-7, miR-100和miR-125表达水平的变化与体内20E的滴度变化趋势是一致的，抑制let-7或miR-100可导致成虫翅明显变小、翅脉畸形(Rubio and Belles, 2013)。果蝇中miR-14以及家蚕中miR-281被证明可通过负反馈调控20E受体EcR-B基因的表达而参与20E对变态发育的调控(Varghese and Cohen, 2007; Jiangetal., 2013)。此外，He等(2019)在家蚕中发现，miR-14可通过同时靶向20E合成通路中的关键酶及重要调控因子而快速降低蜕皮后虫体20E滴度，实现对家蚕蜕皮发育的调控。相对于20E，目前有关miRNA与JH协同调控昆虫变态发育的研究多数集中于miRNA与JH初级反应基因Kr-h1之间的靶向关系。有关miRNA靶向调控JH合成通路中的关键酶的研究多数停留在预测阶段。Qu等(2017)在果蝇中证实bantam可靶向抑制JHAMT的表达，咽侧体中超表达bantam(Aug21-Gal4>UAS-bantam)导致果蝇以隐成虫状态死亡。然而Liu等(2009)报道JH缺失果蝇(Aug21-Gal4>UAS-Grim)在预蛹期死亡。这一表型差异是否是由于JHAMT还受到其他miRNA的靶向作用抑或存在其他作用机制呢？因此，为深入研究miRNA与果蝇JHAMT的靶向关系及其在调控果蝇变态发育中的作用，本研究借助生物信息学软件预测结合双荧光素酶检测系统以及miRNA超表达果蝇的生理功能检测，最终发现并阐明miR-252-5p可通过靶向抑制JHAMT的转录表达参与调控JH生物合成，从而调控果蝇变态发育。本研究结果可为其他昆虫中的相关研究提供借鉴，同时拓展了miRNA与JH互作调控昆虫变态发育的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验细胞和昆虫

本研究所用黑腹果蝇S2细胞购自Invitrogen公司、转基因果蝇品系UAS-miR-252购自BloomingtonDrosophilaStock Center，JHAMT-GAL4/Cyo和Arm-GFP由华南师范大学生命科学学院昆虫发育与应用技术重点实验室李胜教授惠赠，野生型果蝇W1118为本实验室饲养。细胞培养使用添加5%胎牛血清(Fetal bovine serum, South American Origin, Hyclone)的Schneider果蝇细胞培养基(Schneider’sDrosophilaMedium 1×, Liquid, Gibco, Invritogen)，在27℃生化培养箱中培养。当细胞密度达到106/mL时，以1∶5的比例转移至新鲜培养基。果蝇培养基为标准的玉米红糖培养基(玉米粉80 g，红糖125 g，酵母16 g，琼脂5 g加水至1 L，防腐剂为6 mL丙酸、2 g对羟基苯甲酸甲酯溶于20 mL无水乙醇)。所有黑腹果蝇培养于25℃，相对湿度60%，光周期12L∶12D的人工气候箱。

1.2 靶向调控JHAMT的miRNA的预测

使用TargetScan (http:∥www.targetscan.org/fly_72/), miRanda (http:∥www.microrna.org/microrna/getGeneForm.do)和microT-CDS(http:∥diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php?r=microT_CDS/index) 在线分析网站对靶向果蝇JHAMT基因3′UTR处的潜在miRNA进行预测。过滤参数设置：TargetScan和miRanda使用默认过滤参数，microT-CDS选择过滤阈值为0.5。取3个网站均能预测到的miRNA作为候选miRNA。

1.3 双荧光素酶系统验证候选miRNA与JHAMT的靶向关系

根据Flybase上发布的JHAMT的3′UTR序列，利用Primer Premier 5设计JHAMT3′UTR的扩增引物(表1)，提取黑腹果蝇S2细胞RNA并反转录cDNA为模板，进行PCR扩增，片段大小为163 bp。PCR反应体系: 5×PS Buffer 10 μL, 2.5 μmol/L dNTPs 1.0 μL, 上下游引物(20 μmol/L)各0.5 μL, cDNA 1 μL, Primer STAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μL) 0.5 μL, ddH2O 35.5 μL。反应程序: 95℃ 5 min; 95℃ 30 s, 65℃ 30 s, 72℃ 1 min, 30个循环；72℃ 10 min。PCR产物采用琼脂糖凝胶回收试剂盒(Omega)进行回收。回收后片段，通过XhoⅠ和XbaⅠ双酶切连接至改造的荧光素酶报告基因载体pAc5.1-luciferase上(Heetal., 2020)，构建野生型JHAMT荧光素酶报告基因载体。将JHAMT3′UTR区miR-252-5p结合位点序列GUACUUA设计突变为GUUCCUC，含突变位点的全长序列由上海捷瑞生物科技有限公司合成，连接至pAc5.1-luciferase载体，构建突变型JHAMT荧光素酶报告基因载体。

表1 引物信息Table 1 Primer information

为了确证4个候选miRNA(miR-252-5p, miR-277-3p, miR-1002-5p和miR-987-5p)与JHAMT是否存在靶向调控关系，利用双荧光素酶检测系统检测各miRNA模拟物mimics对荧光素酶活性的影响。将黑腹果蝇S2细胞接种至24孔板中。参照Effectene转染试剂说明书(Qiagen)，当细胞密度达约60%～70%时，将构建好荧光素酶报告基因载体、各个候选miRNA模拟物mimics和阴性对照(negative control, NC) (上海吉玛)以及内参海肾荧光素酶载体共转染至S2细胞中，其中miRNA mimics和NC转染浓度为20 pmol/孔，荧光素酶报告基因载体转染浓度为200 ng/孔， 海肾荧光素酶载体转染浓度为2 ng/孔。每组实验3个重复，转染24 h后，收集细胞，利用双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega)进行荧光素酶活性检测。实验结果以荧光素酶(F)与海肾荧光素酶(R)活性的比值(F/R)进行分析。

同理，为了确证miR-252-5p对JHAMT的靶向调控作用，将JHAMT3′UTR区中miR-252-5p结合位点突变的荧光素酶报告基因载体与miR-252-5p模拟物mimics共转S2细胞，进行双荧光素酶检测。

1.4 qRT-PCR检测miRNA及JHAMT表达

利用Trizol法提取野生型黑腹果蝇产卵后0-2, 24, 48, 72和96 h以及游走早期、游走晚期、白色预蛹期和蛹壳形成后12 h这9个发育阶段全虫总RNA(或游走早期特定果蝇品系脑-环腺组织的总RNA)。取2 μg总RNA利用miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit(北京天根)合成cDNA第1链，稀释10倍后，利用miRcute miRNA qPCR Kit(北京天根)进行qRT-PCR，检测miRNA的表达，实验设置3次生物学重复及3次技术重复。反应体系: 2×miRcute Plus miRNA Premix 10 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL, cDNA模板 2 μL, 加水补至20 μL。反应程序: 95℃ 15 min; 94℃ 20 s, 65℃ 30 s, 72℃ 34 s, 5个循环; 94℃ 20 s, 60℃ 34 s，40个循环。内参基因为18S rRNA基因。

取上述9个发育阶段样品总RNA，参照TaKaRa反转录试剂盒说明书合成cDNA，cDNA模板稀释10倍后，利用SYBR-Green Mix(TOYOBO)对JHAMT进行qRT-PCR检测，实验设置3次生物学重复及3次技术重复。反应体系: cDNA 2 μL,Realtime Master Mix 10 μL, 上下游引物(20 μmol/L)各0.5 μL, 加水补至 20 μL。反应程序: 95℃ 1 min; 95℃ 15 s, 58℃ 30 s, 72℃ 30 s, 40个循环。内参基因为rp49。引物见表1。

1.5 咽侧体中超表达miRNA

为了进一步确证miR-252-5p可在虫体靶向抑制JHAMT基因的转录表达，我们利用转基因果蝇GAL4-UAS系统在咽侧体中特异性地超表达miR-252，检测JHAMT和JH初级反应基因Kr-h1的转录表达水平(qRT-PCR方法同1.4节)。将JHAMT-Gal4/Cyo,Arm-GFP的处女蝇分别和UAS-miR-252，W1118雄果蝇交配，交配2 d后置于25℃条件下葡萄汁平板上产卵2 h，然后放入18℃人工培养箱过夜，约20 h后在体视荧光显微镜下挑取没有荧光的卵，得到咽侧体中特异性超表达miR-252的果蝇(JHAMT-GAL4>UAS-miR-252)卵及对照组果蝇(JHAMT-GAL4>+)卵。分别挑选100粒卵放入培养管中，置于25℃、相对湿度60%和光周期12L∶12D的人工培养箱中培养。24 h后统计孵化出的幼虫数，计算胚胎致死率；将幼虫继续培养，统计蛹数，计算幼虫死亡率；观察成虫羽化情况，计算蛹死亡率及成虫羽化率，共做6次重复。同理，另挑选100粒卵放入培养管中，待有白色预蛹开始出现的时候，每隔8 h统计1次蛹数，以最后全部幼虫化蛹为终点，共做3次重复，最后以达到50%的蛹数目的时间来评估果蝇幼虫期发育时间的长短。挑取白色预蛹雌雄果蝇各10头，称重，计算蛹重，实验重复6次。

1.6 数据分析

利用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量；采用SPSS Statistics 16.0软件进行数据处理，以平均值±标准误表示，并采用单因素方差分析和t检验进行差异显著性分析。

2 结果

2.1 靶向果蝇JHAMT的miRNA预测

利用Targetscan, miRanda和microT-CDS在线预测网站预测靶向果蝇JHAMT基因的miRNA，分别得到18, 5和16个miRNA，其中4个miRNA (miR-252-5p, miR-277-3p, miR-1002-5p和miR-987-5p)可被这3个预测网站共同预测到，推测这4个miRNA可能为靶向调控果蝇JHAMT的候选miRNA。

2.2 候选miRNA与JHAMT靶向调控关系的验证

结果发现，与转染阴性对照(NC)相比，转染miR-252-5p模拟物mimics后，细胞内荧光素酶活性下降了34%，达显著水平(P<0.01)，而转染其他miRNA模拟物mimics后，无显著影响(图1: A)，表明miR-252-5p对JHAMT基因存在靶向调控关系。进一步结果显示，当JHAMT3′UTR区中miR-252-5p结合位点突变后，荧光素酶的活性不再被miR-252-5p模拟物mimics所抑制，并且突变后的荧光素酶的活性显著高于转染阴性对照(NC)和野生型JHAMT3′UTR萤火虫荧光素酶报告基因载体组(NC+WT)(图1: B)。以上结果表明，4个候选miRNA中，仅miR-252-5p对JHAMT有靶向调控作用。

图1 利用双荧光素酶系统验证果蝇4个候选miRNA模拟物与黑腹果蝇JHAMT的靶向关系(A)和miR-252-5p对JHAMT的调控作用(B)Fig. 1 Verification of the targeted relationship between the four candidate miRNA mimics and JHAMT in Drosophilamelanogaster (A) and the regulation of miR-252-5p on JHAMT (B) by dual luciferase assay systemNC: 阴性对照Negative control; NC+WT: 野生型JHAMT 3′UTR荧光素酶报告基因载体Wild-type JHAMT 3′UTR luciferase reporter gene vector; 252+WT: miR-252-5p模拟物+野生型JHAMT 3′UTR荧光素酶报告基因载体miR-252-5p mimics plus the wild-type JHAMT 3′UTR luciferase reporter gene vector; 252+MT: miR-252-5p模拟物+突变的JHAMT 3′UTR荧光素酶报告基因载体 miR-252-5p mimics plus the mutated JHAMT 3′UTR luciferase reporter gene vector. 图中数据为平均值±标准误；柱上星号表示与阴性对照相比差异极显著(P<0.01, Student氏t检验)；柱上不同小写字母表示差异显著(P<0.05, Duncan氏多重比较)。Data in the figure are mean±SE. Asterisk above bars indicates extremely significant difference from the negative control (P<0.01, Student’s t-test) and different small letters above bars indicate significant difference (P<0.05, Duncan’s multiple test).

2.3 miR-252-5p与JHAMT在黑腹果蝇各发育阶段的表达模式

结果显示，JHAMT的表达水平在黑腹果蝇预蛹期前处于较高水平，而在预蛹期急剧下降；相反，miR-252-5p的表达水平在游走期前始终处于低表达状态，而在预蛹期急剧上升(图2)，该结果进一步暗示miR-252-5p在虫体内也可负调控JHAMT的转录。

图2 JHAMT和miR-252-5p在黑腹果蝇各发育阶段的表达模式Fig. 2 Expression profiles of JHAMT and miR-252-5p inDrosophila melanogaster at different developmental stagesAEL: 产卵后After egg laying; EW: 游走早期Early wandering stage; LW: 游走晚期Late wandering stage; WPP: 白色预蛹期White prepupal stage; APF: 蛹壳形成后After puparium formation.

2.4 超表达miR-252降低JHAMT的表达并影响JH信号活力

qRT-PCR检测结果发现，与对照组(JHAMT-GAL4>+)相比，游走早期miR-252超表达果蝇(JHAMT-GAL4>UAS-miR-252)脑环腺组织中JHAMT的表达水平下降了约60%，两者差异极显著(P<0.01)(图3: A)；同时脑环腺组织中JH初级反应基因Kr-h1的表达水平也极显著下降(P<0.01)，为对照组的59%(图3: B)。以上结果表明，miR-252-5p可能通过靶向降低JHAMT的表达，进而阻碍JH合成，从而降低JH信号活力。

图3 qRT-PCR检测黑腹果蝇游走早期咽侧体中超表达miR-252后脑环腺组织中JHAMT(A)和JH初级反应基因Kr-h1(B)的表达量Fig. 3 Expression levels of JHAMT (A) and the JH primary response gene Kr-h1(B) in the brain-ring gland during the earlywandering stage of Drosophila melanogaster after overexpression of miR-252 in corpora allata by qRT-PCR图中数据为平均值±标准误；柱上星号表示差异显著(P<0.05, Student氏t检验)。Data in the figure are mean±SE. Asterisk above bars indicates significant difference (P<0.05, Student’s t-test). 图4同The same for Fig. 4.

2.5 超表达miR-252影响果蝇变态发育

结果表明， miR-252超表达造成果蝇化蛹时间推迟(图4: A)，并且白色预蛹期雌雄个体显著变小，与对照组相比，体重分别下降约31%和80%，差异极显著(P<0.01)(图4: B)。更为重要的是，miR-252超表达果蝇不能羽化为成虫，对蛹的致死率达到约63%(图4: C)。表型观察发现，蛹表现出一系列发育缺陷(图4: D)，如蛹前气门翻转缺陷(黑色星号所示)、头部不能正常翻转(箭头所示)、蛹壳不同部位出现中空(红色星号所示)以及成虫头部发育缺陷(白色星号所示)等。以上结果表明miR-252超表达影响果蝇正常变态发育。

图4 咽侧体中超表达miR-252对黑腹果蝇发育的影响Fig. 4 Effects of overexpression of miR-252 in corpora allata on the development of Drosophila melanogasterA: 对化蛹时间的影响Effect on pupation time; B: 对蛹重的影响Effect on pupal weight; C: 成虫羽化百分比以及胚胎、幼虫及蛹期的致死率Percentage of adult eclosion and lethality rates at the embryonic, larval, and pupal stages; D: 蛹期致死表型Lethal phenotypes at the pupal stage. 蛹前气门翻转缺陷用黑色星号指示, 头部不能正常翻转用箭头指示, 蛹壳不同部位出现中空用红色星号指示, 成虫头部发育缺陷用白色星号指示。Defective anterior spiracle eversion is indicated by black asterisks, abnormal head eversion by arrowhead, empty portions in the pupae by red asterisks, and defective adult head development by white asterisks.

3 讨论

本研究借助 miRNA 与靶基因预测软件对靶向调控果蝇JHAMT基因的miRNA进行预测，通过双荧光素酶检测系统及转基因果蝇体内验证等一系列方法确证了miR-252-5p可靶向调控果蝇JHAMT的转录表达。进一步我们发现咽侧体中特异性超表达miR-252后，JHAMT和Kr-h1的转录水平显著下降，并且表现出虫体发育延迟、个体变小、蛹期死亡等表型，以上结果表明miR-252-5p通过抑制JHAMT的转录表达参与调控JH生物合成，进而调控果蝇变态发育。

早期 Lim等(2018)报道20E可促进miR-252的表达，S2细胞中RNAi 20E受体EcR或虫体中超表达EcR显性失活(dominant-negative)基因EcRF645A均可阻碍20E诱导的miR-252表达。在果蝇整个发育阶段中，蛹及成虫时期miR-252的表达显著高于胚胎及幼虫阶段，这与我们的结果(图2)相吻合。miR-252这一表达量的剧烈变化，暗示其在果蝇变态发育过程中发挥着重要的作用。Lim等(2019)证明miR-252可通过靶向抑制p21激活激酶mbt的表达调控果蝇生长发育。研究发现，脂肪体中超表达miR-252导致果蝇幼虫-蛹变态发育推迟，幼虫、蛹及成虫个体变小；而若同时过表达mbt则可挽救上述缺陷表型。本研究在JH合成部位——咽侧体中过表达miR-252抑制了JHAMT的表达，同样导致果蝇变态发育推迟(图4: A)、个体变小(图4: B)、但成虫不能正常羽化(图4: C)，这一差异可能是由于miR-252在不同组织中作用的靶基因不同所致。值得注意的是，Qu等(2017)利用miRNA pull-down方法检测发现bantam, miR-252以及miR-304均可直接结合JHAMT转录本，但是利用Aug21-GAL4分别在咽侧体中超表达这3个miRNA，仅Aug21-GAL4>UAS-bantam果蝇在蛹期死亡，Aug21-GAL4>UAS-miR-252以及Aug21-GAL4>UAS-miR-304无异常表现。而本研究利用JHAMT-GAL4驱动miR-252-5p在咽侧体中过表达导致果蝇在蛹期死亡，推测其原因可能是JHAMT-GAL4在咽侧体中的表达强度高于Aug21-GAL4 (Wenetal., 2015)，从而导致JHAMT-GAL4>UAS-miR-252的表型强于Aug21-GAL4>UAS-miR-252。此外，需要注意的是，早期我们研究发现JH缺失果蝇Aug21-GAL4>UAS-Grim在预蛹期即死亡(Liuetal., 2009)，而本研究发现JHAMT-GAL4>UAS-miR-252果蝇可发育至蛹的多个阶段而死亡(图4: D)；同时Aug21-GAL4>UAS-bantam果蝇也是以隐成虫状态死亡(Quetal., 2017)。miR-252和bantam超表达果蝇的致死表型弱于JH缺失果蝇Aug21-GAL4>UAS-Grim的表型，进一步暗示了JHAMT可能同时受miR-252和bantam的调控。抑或是由于JHAMT主要影响果蝇体内JHB3和JHIII的合成(Wenetal., 2015)，而体内残留的大量MF可继续调控果蝇变态发育。然而与miR-252和bantam超表达果蝇表型矛盾的是，JHAMTRNAi对果蝇发育无明显影响(Niwaetal., 2008)，且JHAMT突变果蝇虽然发育推迟，但80%以上可正常羽化(Wenetal., 2015)。我们推测一方面可能是由于miRNA可作用多个靶基因，bantam和miR-252超表达后不仅仅降低了JHAMT的表达，还影响其他靶基因的功能；另一方面bantam和miR-252均受20E的调控，二者超表达后可能也影响了20E信号通路，从而最终导致果蝇变态发育异常。

尽管如此，本研究至少发现miR-252-5p可靶向抑制JHAMT的表达而参与JH对果蝇变态发育的调控。该研究一方面拓展了miRNA与JH互作调控昆虫变态发育的分子机制，同时为日后开发设计高效低廉的杀虫剂提供了理论支撑。