邢 凯，翟丽维，侍玉梅，沈 奥，曹永春，王楚端*，白立景

（1.北京农学院动物科学技术学院，北京 102206；2.中国农业大学动物科学技术学院，北京 100193；3.中国农业科学院农业基因组研究所，广东深圳 518120）

肝脏是动物机体最大的腺体器官，也是体内最重要的代谢器官，功能广泛。在哺乳动物体内，肝脏在胆固醇代谢、氨基酸代谢、脂质代谢和体内能量的稳态等方面发挥着重要功能。在猪上，肝脏则是极低密度脂蛋白的合成分泌、胆固醇的从头合成、脂肪酸氧化的主要部位。还有研究发现，猪肝脏中也能进行少量的脂肪酸从头合成。可见，肝脏在脂肪、胆固醇、脂蛋白等多种脂质的合成和代谢中发挥着主要作用。

转录组测序技术是一种基于高通量测序技术分析转录组表达的技术，具有灵敏度高、成本低、检测范围广等特点。比较不同脂肪沉积能力猪肝脏的转录组测序结果是鉴定影响猪脂肪沉积关键基因的主要方法之一。吴正明等比较了肉质兼用型品种撒坝猪和瘦肉型猪杜洛克猪的肝脏转录组，发现等基因和PPAR 信号通路等通路在脂肪沉积过程中发挥了重要作用。Huang 等比较了金华猪和长白猪肝脏转录组，发现部分差异表达基因参与了氧化还原、脂质合成和代谢的过程。Sodhi 等比较了韩国本地猪和巴克夏猪肝脏的转录组，结果表明差异表达基因显著富集在物质代谢、免疫应答和蛋白质绑定等过程。同时，转录组测序技术也应用于不同脂肪沉积能力猪肝脏组织转录组研究。Li比较了不同背膘厚度沂蒙黑猪的肝脏转录组，鉴定出CYP1A1/2、HMGCS2、ACSS2 和 UBE2L6 等基因为影响脂肪沉积的关键基因。Xing 等通过分别比较不同背膘厚度的长白猪和松辽黑猪肝脏转录组发现，差异表达基因主要参与了脂质代谢的过程。但是，不同研究间的结果并不尽相同。

本研究以不同背膘厚度长白猪和松辽黑猪肝脏转录组为研究对象，系统分析品种和背膘厚度对肝脏中基因表达的影响，以期鉴定猪肝脏中影响猪脂肪沉积的关键基因。

1 材料与方法

1.1 实验材料 本研究选择了具有显著差异背膘厚度的6 头长白猪和松辽黑猪（每个品种内背膘厚高低个体各3 头）为实验动物。品种内背膘厚度高低个体间脂肪沉积能力差异极显著。实验动物屠宰后，采集肝脏组织样品，立即保存于液氮用于后续实验。

1.2 文库的构建和测序 采用Trizol 法提取肝脏组织的总RNA。1% 琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 检测RNA的质量、浓度和纯度。质量合格的RNA 用于反转录为cDNA，并构建测序文库。文库质检合格后，在Illumina Hiseq 2000 平台上进行双端转录组测序。

1.3 测序数据的处理 使用软件Trimmomatic删除raw data 中接头序列和低质量reads 后，获得高质量clean reads 进一步用于后续分析。使用软件Bowtie2建立猪基因组（Sscrofa 11.1,ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-99/fasta/sus_scrofa/dna/）索引。使用TopHat v2.0.1软件将clean reads 比对到猪参考基因组上。使用HT-seq 软件鉴定基因在不同样本中的表达量。

1.4 差异表达基因分析 为分析品种和背膘厚度对肝脏中基因表达水平的影响，R 包DEseq2 被用于鉴定差异表达基因（Differentially Expression Genes,DEGs）。采用一般线性模型为y=breeding+backfat+breeding*backfat，其中breeding 为品种的效应；backfat 为背膘厚度的效应；breeding*backfat 为二者的交互作用。筛选条件为FDR<0.05 及|logFC|>1。

1.5 差异表达基因分析 为进一步分析DEGs 的生物学功能，在线分析平台Omicshare Tools（https://www.omicshare.com/tools/）用 于DEGs 的GO 和KEGG 功能富集分析及可视化。value<0.05 通路和GO 条目为DEGs 显著富集的通路。

2 结果

2.1 基因整体表达水平 测序数据经质控、比对到基因组上后，每个样本平均获得2.19×10条reads。这些reads 在12 个样本中共被注释到24 796 个基因上。通过相关性分析后发现，不同样本间基因表达水平的相关性都在0.8 以上（图1A），且其中的78.89%在4 个分组中都有表达（图1B）。

图1 基因的整体表达水平

2.2 差异表达分析 使用DESeq2 系统分组分析不同表型和品种对肝脏组织中基因表达的影响。以FDR<0.05及|logFC|>1 为筛选条件，在不同表型猪肝脏中共鉴定出差异表达基因395 个，其中厚背膘组猪肝脏中高表达基因177 个，薄背膘组猪肝脏中高表达基因218 个（图2A）。以同样的筛选条件，在不同品种猪肝脏中共鉴定出差异表达基因458 个，其中松辽黑猪肝脏中高表达基因134 个，长白猪肝脏中高表达基因324 个（图2B）。

图2 差异表达基因火山图

2.3 差异表达基因功能富集分析 对不同表型猪肝脏中差异表达基因KEGG 通路功能富集分析，共鉴定出显著富集的通路18 条（<0.05）。其中花生四烯酸代谢、谷胱甘肽代谢、P450 细胞色素代谢过程、脂肪酸代谢、胰岛素抵抗、皮质醇的合成和分泌等通路影响脂质在体内的积累和代谢。

对不同猪种间差异表达基因进行KEGG 通路分析，发现26 条显著富集的通路。其中PPAR 信号通路、新陈代谢通路、细胞色素P450 代谢通路、鞘糖脂生物合成通路、脂肪细胞内脂质分解调控通路、甘油三酯代谢通路、主要胆汁酸合成、MAPK 信号通路等在脂肪合成和代谢过程中发挥着重要作用。

通过GO 分析结果发现，不同表型间的差异表达基因显著富集GO 条目94 条；不同品种间差异表达基因显著富集GO 条目84 条。这些GO 条目主要参与了氧化还原酶的激活、脂肪酸链延长酶激活、脂肪酸生物合成、各种小分子的绑定、多种物质代谢的激活、免疫激活等过程。

3 讨 论

肝脏是调控猪体内物质代谢最重要的器官之一，同时也调控着其体重和采食量。近年来，通过转录组测序技术挖掘肝脏中与猪重要经济性状相关基因的研究也越来越多。但是，多数研究只针对一对比较，影响因素较多，导致各研究之间的结果差异很大。本研究系统分析了不同背膘厚度的长白猪和松辽黑猪的肝脏转录组，采用DEseq2 中双因素的方法鉴定差异表达基因，更好地剖分了不同分组之间的影响因素，减少了结果的假阳性。

在本研究中，395 个差异表达基因在不同表型猪肝脏组织中被检测到。先前研究报道，肝脏主要参与脂肪降解的过程，并未参加脂肪酸从头合成的过程。但是，本研究发现，3 个脂肪酸合成关键基因乙酰辅酶A 羧化 酶（Acetyl-CoA Carboxylase Alpha，）、ELOVL 脂肪酸延长酶 6（ELOVL Fatty Acid Elongase 6，）和酮戊二酸脱氢酶L（Oxoglutarate Dehydrogenase L，）在厚背膘组显著高表达。ACACA 编码乙酰辅酶A 羧化酶，催化乙酰辅酶A 转化为丙二酰辅酶A，是脂肪酸从头合成的限速步骤。基因是超长链脂肪酸延长和去饱和的关键基因。参与了三羧酸循环的过程，其为脂肪酸的从头合成提供。这表明，猪肝脏中也可能发生了脂肪酸从头合成的过程，进而影响了脂肪沉积的能力。肝脏中差异表达基因涉及了多种物质的代谢，如药物、长链脂肪酸、外源物质、氨基酸等。这与肝脏在机体内解毒的生物学功能相一致。肉碱棕榈酰转移酶1A（Carnitine Palmitoyltransferase 1A，）、谷胱甘肽 S-转移酶 omega 2（Glutathione S-transferase Omega 2，）、-谷氨酰转移酶5（Gammaglutamyltransferase 5，）等基因，在多种物质的代谢中发挥着重要的作用。可以催化线粒体摄入长链脂肪酸，是长链脂肪酸氧化的限速步骤。当肝脏中表达水平较高时，可以增加脂肪酸的降解和减少机体脂肪的含量。和在谷胱甘肽代谢中发挥着重要作用。谷胱甘肽是种氧化还原缓冲剂，具有清除自由基、解毒、修复蛋白、合成DNA等多种免疫和抗氧化应激的功能。这些基因在薄背膘组猪肝脏中表达水平更高，表明其氧化脂肪酸的能力更强。是一个调控细胞营养内稳态的转录因子，可以通过影响采食量来调控哺乳动物的脂质代谢。与本研究结果一致，肥胖组个体肝脏中基因的表达水平较高。这些表明，猪肝脏中脂肪的生成和分解过程都影响了脂肪沉积的多少。

图3 不同表型猪肝脏中差异表达基因富集的通路

图4 不同品种猪肝脏中差异表达基因富集的通路

图5 差异表达基因显著富集的GO 条目

松辽黑猪是一个培育品种，在生长性能和免疫性状上与瘦肉型猪都有显著的差异。在本研究中，松辽黑猪和长白猪肝脏间共检测到458 个差异表达基因。差异表达基因等显著富集到PPAR 信号通路。PPAR 信号通路是维持体内调控能量平衡、脂质代谢、细胞分化和增殖的关键通路。其中，编码的蛋白是最丰富的脂滴蛋白，可以促进脂肪细胞内脂滴的生成。酶在线粒体中催化中链脂肪酸的氧化，并间接影响了甘油三酯的代谢。是甘油三酯的运输蛋白。敲除基因的小鼠，增加了其甘油激酶的活性，促进了甘油三酯的生成，导致小鼠的肥胖和代谢障碍。是一个脂肪细胞因子，其紊乱可提高脂肪生成和抑制脂肪酸氧化引起脂肪肝、肥胖和胰岛素抵抗。是核受体蛋白PPAR 家族中的一员，可调节细胞的脂肪酸氧化、线粒体功能、胰岛素抵抗等。可见，PPAR 信号通路中关键基因的差异表达引起了不同品种猪间的脂肪沉积能力差异。这与上述同一品种中猪脂肪沉积能力差异的原因并不相同。同样，不同品种猪肝脏中发现免疫相关基因差异表达，如：等。是T 淋巴细胞表达的共刺激分子，可以促进T 细胞的活化、增殖和产生细胞因子，对于调节性T 细胞存活和维持免疫稳态至关重要。是一种通过糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定于细胞膜表面的补体调节蛋白,具有抑制同源补体攻膜复合物（MAC）形成和参与介导T 细胞活化等多种功能,进而保护宿主细胞。是一种诱导共刺激分子，优势表达在活化的T 细胞表面，在机体的免疫反应调节中发挥重要的生物学作用。是一种G 蛋白偶联受体，主要参与免疫系统中T 细胞活化，介导细胞黏附、迁移及运动等。在癌症中，能够激活肿瘤干细胞，可促进癌细胞的增殖，并通过激活肿瘤细胞逃逸宿主免疫机制以抑制肿瘤细胞凋亡。基因也称原癌基因，其编码蛋白在细胞增殖、分化和转化的过程中发挥关键作用。它也可以通过细胞凋亡作用引起先天性全身性脂肪营养不良和增殖性筋膜炎。INF 是调节免疫应答过程中的细胞因子，在细胞抗病毒免疫中发挥重要的作用，其血清学水平与肝脏疾病的严重程度密切相关。以上这些基因在2个品种猪肝脏中表达的差异，可能引起了他们免疫性状上的不同。

4 结 论

本研究系统分析了具有2 个品种内显著差异脂肪沉积能力的松辽黑猪和长白猪的肝脏组织测序数据。不同表型间差异表达基因结果提示，等基因是肝脏中调控脂肪合成和代谢的关键基因；不同品种间差异表达基因分析表明，PPAR 信号通路改变了2 个品种间脂肪沉积能力，且等基因调控了免疫性状。本研究对猪脂肪性状的遗传改良、肝脏功能解析有一定意义。