王 芬,何华亮,刘铜华,吴丽丽

(1.北京中医药大学第三附属医院，北京 100029；2.解放军武装警察部队北京市总队医院，北京 100027；3.北京中医药大学，北京 100029)

2型糖尿病(Diabetes mellitus type 2,T2DM)已经成为全球面临的严重的公共卫生问题。近年来，全球糖尿病的医疗成本至少是人均医疗保健支出的3.2倍，糖尿病并发症的医疗成本较前上升到9.4倍[1]。同时，随着与2型糖尿病发病密切相关的超重和肥胖的增长，该病已成为未来代谢性疾病发展趋势更严重的预测代表[2-3]。目前已公认，机体的慢性低度炎症反应不仅参与肥胖的病理过程，也是2型糖尿病的发病机制之一。许多研究表明[4]，肥胖和T2DM患者的C-反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和单核细胞趋化因子1(MCP-1)等细胞因子的水平均有所升高；炎症在T2DM的发病机制中起媒介作用[5]。此外，针对改善全身促炎细胞因子水平，如NF-κB途径，有可能恢复胰岛素敏感性和改善血糖水平[6-7]。其中，以Toll样受体系列(TLR)为代表的炎症反应的启动因子，在激活免疫细胞后，加剧原炎性细胞因子的产生，继而激活应激激酶如IKK和JNK等，使它们磷酸化胰岛素受体底物-1(IRS-1)，起到阻止胰岛素受体的信号转导并引发胰岛素抵抗的作用[8]。因此，虽然2型糖尿病发病是由代谢失调引起，但已有学者建议将其视为一种自身炎症性疾病[9]。

结合中医药在2型糖尿病及代谢异常干预的研究结果，我们发现其有巨大的研究潜力。中药复方糖耐康是治疗2型糖尿病经验方，主要针对消渴病燥热内盛、气阴亏虚的病机，是在辨证论治基础上结合多年临床经验及药理研究成果组方而成。前期研究结果表明，该方具有明确的改善胰岛素抵抗、调节糖脂代谢、调节肠道菌群的作用[10]。为了进一步探究其作用机制，本项研究选取低度炎症信号通路部分关键靶点作为观察指标，旨在明确其作用机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物及饲料：SPF 级雄性 KKAy 小鼠 65 只及 C57BL/6J 小鼠 13 只，均购自北京华阜康生物科技有限股份公司[动物许可证号:SCXK(京)2014-0004]，10 周龄，体重(35.5±3.0)g。小鼠在无特定病原体(SPF级)条件下饲养于中国中医科学院中医基础理论研究所实验动物中心。小鼠饲养条件:温度 (21±2) ℃，湿度 (60±10) %，12 h /12 h 光照黑暗循环。整体实验均已通过中国中医科学院中医基础理论研究所的动物实验伦理会审查 (编号2018-013)，均符合实验动物伦理委员会的相关指导原则。动物喂养普通饲料及高脂饲料(猪油 10%、蛋黄粉 10%、普通饲料 80%)均由华阜康生物科技股份有限公司提供，在干燥、通风环境储存。

1.1.2 药品及试剂:糖耐康颗粒由北京中医药大学药厂制备，该颗粒由以下药物按照 1∶4∶2∶4∶2 比例组成，包括人参、夏枯草、女贞子、番石榴叶、三白草。3 g/袋，颗粒与生药比按1∶3.61当量换算。用药前以蒸馏水配制，4 ℃ 保存。

TNF-α 酶联免疫试剂盒、IL-1β酶联免疫试剂盒、MCP-1酶联免疫试剂盒(批号L150715400)。Formamide 去离子甲酰胺(批号37B00160)、2×Taq PCR Green Mix(批号55H001200)、核酸染料(批号54D00150)。蛋白质分子量Marker(美国 Bio-rad，批号310007919)，感光胶片(美国柯达，批号020901701)，辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号129736)，PVDF膜(德国 Millipore，批号K1EA1531FK)，ECL(美国Santa Cruz公司，批号I2608)，蛋白酶抑制剂(瑞典 Roche，批号19987900)，NF-κB兔来源的多克隆抗体(美国 Abcam公司，批号GR3236514-1)。

1.1.3 仪器：稳压稳流电泳仪(Bio-Rad Powerpac HQ，USA)，垂直电泳槽(Bio-Rad MP3，USA)，Agilent 2100 生物分析仪 (Agilent Technologies,USA)，电子天平(Sartouris BS224S，GER)，紫外分光光度计，HiSeq2500 型高通量测序仪(美国Illumina公司)，Qubit 2.0 Fluorometer(Invitrogen,Carlsbad,CA)，IlluminaMiSeq仪器，3K15 型高速低温离心机(美国Sigma公司)，T100 型梯度 PCR仪(美国Bio-Rad公司)，微量加样器，DL-CJ-2NDI 型超净工作台(中国东联哈尔仪器制造有限公司)，半干转电转印仪(Bio-Rad Trans-Blot SD，USA)，计算机图像分析仪。

1.2 实验方法

1.2.1 建模、分组及给药：所有小鼠均适应性喂养1周，设雄性C57BL/6J小鼠为正常组，给予普通饲料喂养；雄性KKAy小鼠给予高脂饲料喂养2周后，平均随机血糖≥13.9 mmol/L，均为成模小鼠，共65只。按体重及随机血糖随机分为六组，正常组，阿卡波糖组(3.9 mg/kg)，糖耐康高、中、低剂量组(4.68、2.34、1.17 g/kg)及模型组(0.9%氯化钠溶液20 ml/kg)，每组13只。给药组均按0.01 ml/g的剂量标准灌胃给药1次，正常组、模型组给予相同剂量的0.9% 氯化钠溶液，共连续8周。每周均监测并记录血糖及体重。饲养过程中，全程自由取食、饮水。其中糖耐康中剂量组及模型组各死亡3只，每组各取10只取材。第8周，末次给药后禁食不禁水10 h，予摘除眼球取血，平均约1 ml/只，分离血清备用。

1.2.2 血糖及体重检测：观察小鼠一般情况。在药物干预期间，分别于第 0、4、8 周，在禁食 6 h 后，采用血糖仪尾静脉取血法测定血糖；每周同一时间于清晨7时测量小鼠体重并记录。

1.2.3 ELISA及Western blot检测：半定量检测血浆中 TNF-α 及 IL-1β、MCP-1的水平。每组各取6只检测MCP-1。各项操作均严格按照试剂盒说明书操作。

每组各4只采用Western blot法检测肌肉组织NF-κB的蛋白表达水平。SDS-PAGE 蛋白垂直电泳:上样量约40 μg，90 V 45 min浓缩，150 V 80 min 电泳分离。转膜:按照海绵、滤纸、凝胶、PVDF 膜、滤纸、海绵依次顺序装好转膜装置120 V、150 mA转膜60 min。封闭:15 ml Blocking buffer TTBS 37 ℃ 轻摇 1 h。NF-κB一抗(1∶2000)、GAPDH为内参(1∶5000)。4 ℃孵育过夜，洗膜，加二抗，NF-κB二抗(1∶2000)、GAPDH为内参(1∶3000)。增强化学发光，Storm 扫描，对扫描图像测特异蛋白条带的灰度值。以β-actin 为内参照，每个样品重复测量 3 次。

2 结 果

2.1 各组小鼠一般情况及治疗前后体重变化 正常组小鼠体型适中，行动敏捷，毛色光亮，活动自如。KKAy 组小鼠形体肥胖，活动少，动作迟缓，摄食量及饮水量均增多。灌胃后期出现毛色凌乱、竖毛、动作缓慢、反应迟钝。

模型组与各给药组均有不同程度体重上升，考虑与其高脂饲料喂养有关。与模型组比较，给药组在降低体重方面差异有统计学意义(P<0.01)。与阿卡波糖组比较，糖耐康各剂量组的体重控制趋势较为明显。见表1。

表1 各组小鼠治疗前后体重比较(g)

2.2 各组小鼠治疗前后血糖变化比较 中药复方糖耐康能够明显改善2型糖尿病小鼠血糖，糖耐康高剂量组与模型组血糖比较差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 各组小鼠治疗前后血糖变化比较(mmol/L)

2.3 各组小鼠TNF-α、IL-1β 水平比较 阿卡波糖组和糖耐康高剂量组与模型组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)，说明其具有明确的下调作用，其余给药组均有一定的下调趋势，见表3。

表3 各组小鼠 TNF-α、IL-1β 水平比较(ng/L)

2.4 各组小鼠MCP-1水平比较 对于MCP-1水平，糖耐康高剂量组与模型组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 各组小鼠MCP-1水平比较(pg/ml)

2.5 各组小鼠胰腺组织 MCP-1 病理学变化比较 胰腺胰岛及腺泡细胞均着色，其中模型组染色阳性表达最强，其他用药组均弱于模型组，糖耐康高剂量组染色弱阳性表达，正常组表达最弱(图1)。

A：正常组；B：模型组；C：阿卡波糖组；D：糖耐康高剂量组；E：糖耐康中剂量组；F：糖耐康低剂量组

2.6 各组小鼠NF-κB 蛋白表达水平比较 与模型组比较，阿卡波糖组与糖耐康高剂量组差异均有统计学意义(P<0.05)，具有明确的下调作用，其余给药组均有一定的下调趋势，见表5(图2)。

表5 各组小鼠NF-κB 蛋白表达水平比较

1：正常组;2：模型组;3：阿卡波糖组;4：糖耐康高剂量组;5：糖耐康低剂量组;6：糖耐康中剂量组

3 讨 论

随着糖尿病发病机制研究的不断深入，诸多证据表明，低度炎症学说的分量在该疾病的发病机制中占比日益剧增。已有人强烈呼吁将抗炎剂纳入2型糖尿病的治疗方案中[11]。已证实，在炎症信号通路中，对于肥胖和T2DM患者，其脂肪组织中TNF-α 水平及生物活性较高[12-13]，肥胖会导致脂肪分解和大量促炎性FFA释放，增加局部炎性因子，促进胰岛素抵抗[14]。现已明确其能够通过抑制脂肪、肌肉组织上的葡萄糖转运，抑制胰岛素敏感性，加速胰岛素抵抗进而影响葡萄糖的正常代谢途径，以促进炎性反应的发生。IL-1β是最早出现的炎症因子之一[15]，属于多效性细胞因子[16]，MCP-1则是较为年轻的一种趋化细胞因子。机体炎性因子水平升高，可激发单核巨噬细胞产生大量 MCP-1[17]。同时，高糖及低密度脂蛋白也可明显刺激系膜细胞及内皮细胞、平滑肌细胞等[18]，改变细胞外调节蛋白激酶/c-Jun N 末端激酶和 NF-κB 的相关信号 CCR2的独立表达分泌 MCP-1，使血管内皮更易受损[19]。因此控制MCP-1水平有助于改善肥胖和胰岛素抵抗状态[20]。另外，脂多糖作为炎性反应的启动因子，也能够通过NF-κB信号通路调控下游各种细胞因子，尤其是炎性因子，诱导炎症反应[21-22]。故加强抑制NF-κB信号通路及炎性因子的水平能够在一定程度上阻断该通路介导的级联反应、延缓糖尿病的发展[23]。我们的研究结果提示，中药复方糖耐康能够明显降低2型糖尿病小鼠空腹血糖水平，降低体重增长的趋势。对比模型组，阿卡波糖组与糖耐康高剂量组能够下调炎性因子TNF-α、IL-1β、MCP-1及NF-κB蛋白表达水平，抑制炎症级联反应，减缓炎症状态。

中药复方糖耐康由夏枯草、番石榴叶、三白草、女贞子及人参五味中药组成。方中夏枯草味苦性寒，具有清肝火散郁结之功，为君药。针对消渴病气郁热盛的病机。臣药番石榴叶、三白草为民间地方药材。其中番石榴叶味甘、涩，性平，具有甘平养胃、生津止渴、敛涩固阴之效。广西医学院糖尿病课题组曾发现其对正常人及糖尿病患者有确切降糖作用，从药理研究证实它能够改善糖尿病胰岛素抵抗[24]。三白草味甘、辛，性寒，具有清热解毒、利水消肿的功效。以上君、臣药针对胰岛素抵抗“实”证燥/热的病理基础。佐药人参、女贞子益气养阴、生津止渴。人参主治虚劳、消渴及气血津液不足之证。女贞一味，培补肝肾之阴以充先天之本。综观全方，从上、中、下三焦入手，顾肺、脾(胃)、肾(肝)三脏之本。清中寓补，泄中有收，标本兼顾，共奏清热生津、益气养阴之效。正对糖尿病前期胰岛素抵抗的主要证候学特点之一。

本研究选取自发性2型糖尿病动物模型KKAy小鼠，其遗传特性和病程发展特点与人类糖尿病类似，环境因素易控制，个体差异性较小[25]，并有较为成熟的技术支持，在实践过程中得到较好的论证，是研究该疾病理想的动物模型。

本研究结果证实，中药复方糖耐康具有明确地降低 2 型糖尿病 KKAy 小鼠的体重趋势及血糖水平。抑制 TNF-α、IL-1β水平，抑制 MCP-1 及 NF-κB 蛋白的表达水平。其作用机制可能是通过调节炎症信号通路中上述关键靶点水平，减轻低度炎症反应，实现改善胰岛素抵抗状态及2型糖尿病的作用。该结论为进一步加强中医药防治糖尿病的研究提供依据。