阙 雷，石红乔，彭 陶，魏跃钢

(1.南京中医药大学第一临床医学院，江苏 南京 210023；2.南京中医药大学附属南京中医院 南京市中医院，江苏 南京 210001)

中医学认为，痤疮是由于肺胃积热，长期不愈，气机不畅，而使痰湿内生，血行瘀滞产生的皮肤疾患。南京市中医院皮肤科治疗室运用中药祛痘1号软膜外敷治疗痤疮多年，取得较好的疗效。该软膜中药成分是在古方“颠倒散”的基础上辨证加减。软膜组成为中药粉及软膜基质。为了进一步探索本药治疗痤疮的原理，本研究通过动物实验观察该药对金黄地鼠背部皮脂腺斑组织大小、微观结构及增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、磷脂酰肌醇3激酶(Phosphoinositide3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(Protein kinase B,Akt)表达的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂及仪器 采用8周龄的雄性金黄地鼠(维通利华实验动物技术有限公司)，清洁级，体重80～120 g；南京中医药大学动物实验伦理批准(202012A021)。

PCNA(Affinity，AF0239)，PI3K抗体(Proteintech，20584-1-AP)，Akt抗体(Abcam，Ab-8805)，DAB(Dako Denmark，K3468)；中药祛痘1号软膜的中药由黄连、大黄、茯苓、虎杖、苦参、丹参、血竭、硫磺组成，均采购于南京市中医院中药房。软膜制备方法：以上八味药物均取干燥药材，按照3∶5∶5∶5∶5∶5∶2∶2的质量比例混合，研成细粉，过300目筛。软膜基质是以海藻酸钠粉、磷酸镁粉、氯化钙粉及生粉按比例混合而成。中药粉和面膜基质按质量1∶9的比例混合备用；维胺酯维E乳膏(国药准字H20059598)；游标卡尺(上海恒量量具)，显微镜(NIKON，H550S)，成像系统(NIKON，DS-RI2)。

1.2 动物模型制备与分组干预 选取金黄地鼠背部皮脂腺斑块作为痤疮模型，将32只雄性金黄地鼠适应性饲养 1 周后，分为四组。空白组：予0.9%氯化钠溶液每日1次搽拭皮脂腺斑块；软膜基质组：予基质外敷30 min后擦去；中药软膜组：予以中药软膜外敷30 min后揭去；阳性对照组：予维胺酯维E乳膏每日1次外用。在干预后第15天，进行指标检测。

1.3 皮脂腺斑面积测量 首次药物干预前及末次药物干预1 d后，用剃刀剃光金黄地鼠背部双侧毛发，充分暴露皮脂腺斑，在光线充足的环境下，利用游标卡尺测量皮脂腺斑块的最大横径(DT)和最大纵径(DL)，两个数值相乘，分别计算出双侧皮脂腺斑的面积。皮脂腺面积=DT(mm)×DL(mm)。

1.4 HE染色观察皮脂腺斑病理结构 在药物干预后第15天，将动物处死，取金黄地鼠背部皮脂腺斑组织，4%多聚甲醛固定后经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后切片行HE染色，显微镜下观察皮脂腺大小、厚度及松散程度。

1.5 免疫组化检测皮脂腺斑PCNA、PI3K、Akt表达 将制备的皮脂腺斑组织切片先后进行脱蜡、水化、抗原修复、封闭、分别予以PCNA、PI3K、Akt一抗孵育、相应种属的二抗孵育后，进行DAB显色反应，镜下观察各组表达情况。

2 结 果

2.1 各组金黄地鼠皮脂腺斑面积比较 见表1。干预前各组皮脂腺斑面积比较差异无统计学意义(P>0.05)。在干预第8天时，各组面积比较差异无统计学意义(P>0.05)。在干预第15天时，中药软膜组和阳性对照组的同侧皮脂腺斑面积小于空白组、软膜基质组，差异有统计学意义(P<0.01)。 中药软膜组和阳性对照组皮脂腺斑的面积相比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组金黄地鼠双侧皮脂腺斑面积比较(mm2)

2.2 各组金黄地鼠组织病理学表现 空白组：金黄地鼠皮脂腺呈分叶状分布，腺体饱满，数量多，排列紧密而厚；软膜基质组：部分皮脂腺较大，排列紧厚；中药软膜组：皮脂腺腺体厚度较空白组变薄，腺体体积变小，排列疏松；阳性对照组：皮脂腺腺体萎缩，数量少。中药软膜组的腺体排列较空白组、软膜基质组松散，腺体变小且数目减少，与阳性对照组效果接近(图1)。

图1 各组金黄地鼠皮脂腺组织病理学表现(HE染色)

2.3 各组金黄地鼠PCNA蛋白表达情况 PCNA蛋白是细胞增殖状态的观察指标，定位在细胞核的位置，阳性细胞的细胞核呈现棕黄色。每张切片任意选取 5 个阳性区域的高倍视野。与空白组、软膜基质组相比较，中药软膜组和阳性对照组整体PCNA的表达都有所下降，其中阳性对照组更为明显。空白组与软膜基质组比较差异无统计学意义(P>0.05)；中药软膜组、阳性对照组皮脂腺斑PCNA表达比空白组下降，差异有统计学意义(P<0.05)。中药软膜组和阳性对照组PCNA表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。 见图2(表2)。

图2 各组金黄地鼠皮脂腺PCNA免疫组化染色

表2 各组金黄地鼠皮脂腺PCNA免疫组化染色OD值

2.4 各组金黄地鼠PI3K、Akt的蛋白表达情况 PI3K、Akt抗体的染色定位在细胞核及细胞浆，呈现棕黄色的即阳性细胞。通过DAB显色反应，镜下观察可见空白组和软膜基质组的阳性细胞数量多于中药软膜组和阳性对照组，并且颜色深，面积大。与空白组、软膜基质组相比较，中药软膜组和阳性对照组整体PI3K、Akt的蛋白表达都有所下降，其中阳性对照组更为明显(图3、4)。

图3 各组金黄地鼠皮脂腺PI3K免疫组化染色

3 讨 论

现代研究显示，雄激素作用下皮肤的皮脂腺及其调控分泌的脂质功能异常，以及微生物感染等因素是引发痤疮的机制之一[1-3]。研究结果显示多条通路与脂质代谢有关，这些通路的激活能引起脂质的异常分泌。胆固醇调节元件结合蛋白(SREBP)是可以影响脂质代谢的重要因子[4-5]，该因子可以调节下游多种脂质合成酶基因的表达，从而能够影响脂质代谢[6-7]。

黄秋红等[8]通过雄激素激活HaCaT细胞的SREBP信号通路，再运用PI3K/Akt通路抑制剂干预，研究结果显示PI3K/Akt信号通路在雄激素激活HaCaT细胞的SREBP信号通路过程中起到重要作用。丁畅等[9]研究发现通过荷叶碱的干预，可以抑制细胞的PI3K/Akt/mTOR通路，达到降低细胞内脂质的合成。在众多与脂质代谢相关联的因素中，PI3K/Akt信号通路是重要的一个部分，该通路与细胞的增殖、代谢过程有着紧密的关系[10]。因此，我们可以通过药物干预皮脂腺细胞中PI3K/Akt通路，调节皮脂合成和分泌，从而达到治疗痤疮的目的。PCNA存在于正常增殖细胞及肿瘤细胞内，在细胞增殖的启动上起重要作用，是反映细胞增殖状态的良好指标[11]。在痤疮患者的皮损中，炎性细胞的浸润和微生物的感染，均可能引起皮脂腺细胞增殖，激活PCNA。在本研究中，我们通过观察中药软膜干预前后皮脂腺组织细胞PCNA表达情况变化，以研究中药1号祛痘软膜的疗效是否跟感染细胞DNA增殖有关系。

研究选择金黄地鼠作为动物实验对象，是因为其背部的皮脂腺斑是天然的研究皮脂腺功能的动物模型，该模型也被国内外认可[12]。顾炜等[13]在研究药物对皮脂腺功能影响时，也曾采用金黄地鼠背部的皮脂腺斑作为动物模型，取得较好的观察效果。对照组药物维胺酯维E软膏是临床治疗寻常痤疮的常用药物，其药物功效包括可以抑制皮肤的脂质分泌。

中医学一般认为痤疮多与肺胃积热有关，若长期不愈，则气机不畅，易导致痰湿内生，血行瘀滞。祛痘1号软膜的中药组方在临床已经使用多年，前期曾有过临床研究资料。张倩等[14]也曾观察过此中药组方的散剂治疗寻常痤疮的临床疗效，取得了满意的效果。

中药组方中大黄清热泻火、祛瘀解毒，为君药。黄连清热解毒，苦参清热燥湿，为臣药。虎杖利湿、散瘀，血竭、丹参皆能活血化瘀、止痛，茯苓健脾除湿，硫磺则具有解毒杀虫之效，共为佐药。而很多现代研究结果也表明，中药在抑制痤疮丙酸杆菌、抑制皮脂分泌等方面有着很好的效果。现代药理研究证实：黄连提取物可抗炎抑菌;大黄具有广谱抗菌和免疫调节的作用[15-16]；硫磺与人体皮肤分泌物作用生成硫化物，可起到软化皮肤角质，抑制皮脂的功效[17]。有现代医学研究报道黄芩苷等药物可抑制皮脂腺细胞的活性[18-19]。本研究的软膜属胶膜型面膜，软膜的成型原理是将溶于水的海藻酸钠与镁盐作用，变成不溶于水的海藻酸镁[20]。在用水调和软膜粉外敷在痤疮部位时，可以控制水分缓缓释放，加强皮肤的水合作用，促进中药成分的透皮吸收，增加治疗效果。

在实验结果中，我们发现与空白组和软膜基质组相比，中药软膜组的大鼠背部皮脂腺斑块面积明显缩小，皮脂腺厚度变薄，腺体体积变小，排列疏松。其PCNA表达降低，凋亡增加，也说明了皮脂腺细胞的增殖受到抑制。PI3K、Akt表达下调，提示了中药1号软膜治疗痤疮的机制，可能跟对PI3K/Akt通路的抑制有关联。而这几项观察指标结果中，中药1号祛痘软膜组和阳性对照组相接近。综上所述，中药祛痘1号软膜可有效抑制皮脂腺增生，为软膜用于临床治疗痤疮提供实验室依据。