刘珊 刘鑫 林友刚

结肠癌是临床上常见的恶性肿瘤，积极探究结肠癌致病机制，是目前医学研究的重点[1]。GATA3及GATA6是GATA转录因子家族成员，可调节Wnt/β-catenin信号通路，参与癌变的发生与发展。有研究表示，GATA3及GATA6表达水平与肠腺窝细胞增殖相关，干扰GATA3/GATA6，能抑制结直肠癌细胞系致瘤能力，降低癌细胞增殖率[2]。GATA3/GATA6在结肠癌的发生及发展中可能也具备相似的作用。细胞自噬在癌变中的作用存在两面性，其既可提高肿瘤对周边环境的适应性，也可诱导肿瘤凋亡[3]。本研究以结肠癌HCT116细胞作为研究材料，利用干扰RNA转染技术，建立干扰GATA3/GATA6的细胞系，探究GATA3/GATA6在结肠癌发展中的价值。

对象与方法

一、对象

人结肠癌细胞株HCT116购自北京肿瘤研究所。RPMI 1640培养液及胎牛血清均购自Cibco公司。RT-PCR试验所需的相关试剂盒购自Takara公司，mTOR、ULK1、LC3-B、β-actin引物序列由Takara公司合成。

二、方法

1.干扰RNA转染：结肠癌HCT116细胞在6孔板中铺板，每孔内分别含有含5 μl小干扰序列以及lipo3000 5 μl。分别在两个含有125 μl完全培养液的离心管内加入5 μl小干扰序列以及5 μl lipo3000，静置5分钟，吸取25 μl混合液于6孔板内，12小时后换液，48小时后提取细胞蛋白及总RNA。

2.细胞凋亡检测：在对数生长期HCT116细胞内加入0.25%蛋白酶消化细胞，制成密度为1×106个/ml的单细胞悬浮液，取1 ml细胞悬浮液，1 000 rpm离心10分钟后弃上清液，预冷PBS清洗。细胞重新悬浮并加入Annexin-V-FITC，室温避光孵育20分钟，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

3.CCK-8检测细胞增殖情况：转染前1天，在96孔板中按5×103个细胞接种，每孔内加入100 μl培养液，每组设4个复孔，共96孔板，分别于转染0、24、48及72小时后，应用CCK-8法检测细胞增殖情况。

4.实时定量PCR：总RNA快速提取试剂盒提取总RNA，miRNA特有的逆转录引物以及逆转录酶应用于反向转录。RT-PCR反应体系：5×PrimeScript Buffer 4 μl，1×PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μl；Oligo dT Primer(50 μm)1 μl(25 pmol)；Random 6 mers(100 μm)1 μl(50 pmol)；Total RNA 1 μl；RNase Free dH2O 12 μl。反应条件：预变性95 ℃ 10分钟，变性94 ℃ 30秒，退火/延伸60 ℃ 1分钟，熔解曲线分析：95 ℃ 15秒，60 ℃ 1分钟，94 ℃ 15秒，60 ℃ 15秒。引物序列见表1。RT-PCR结果由系统软件自动分析得出。

表1 引物序列

5.Western bolt法检测各组蛋白表达：抽取细胞总蛋白，BCA法检测其浓度，加入5×SDS PAGE上样缓冲液混合均匀，95 ℃恒温反应10分钟，取40 μ蛋白进行SDS-PAGE分离，蛋白转移至硝酸纤维素膜，加入TBST封闭液，置于摇床上，37 ℃封闭1.5小时，分别加入mTOR、ULK1、LC3-B以及β-actin抗体，4 ℃摇床过夜，TBST漂洗，加入辣根过氧化酶标记的山羊抗兔二抗，37 ℃孵育1.5小时，TBST洗膜后采用Band Scan软件分析图像，以β-actin抗体作为内参，计算mTOR、ULK1、LC3-B蛋白相对表达量。

三、统计学方法

结果

1.干扰GATA3/GATA6后结肠癌细胞凋亡水平：经流式细胞检测发现，干扰GATA3/GATA6后，结肠癌细胞凋亡率高于空白对照组(P<0.05)，见表2。

表2 干扰GATA3/GATA6后结肠癌细胞凋亡水平

2.干扰GATA3/GATA6后结肠癌细胞增殖水平：干扰GATA3/GATA6后，结肠癌细胞存活率较空白对照组显著下降(P<0.05)，且随时间推移呈依次下降趋势(P<0.05)，见表3。

表3 干扰GATA3/GATA6后结肠癌细胞增殖水平

3.干扰GATA3/GATA6后结肠癌细胞内mTOR、ULK1、LC3-B mRNA表达：干扰GATA3/GATA6后结肠癌细胞内mTOR、ULK1、LC3-B mRNA表达水平均显著下降(P<0.05)，见表4。

表4 干扰GATA3/GATA6后结肠癌细胞内mTOR、ULK1、LC3-B mRNA表达

4.干扰GATA3/GATA6后结肠癌细胞内mTOR、ULK1、LC3-B 蛋白表达：干扰GATA3/GATA6后，结肠癌细胞内mTOR、ULK1、LC3-B蛋白表达量显著低于空白对照组(P<0.05)，见图1。

图1 干扰GATA3/GATA6后结肠癌细胞内mTOR、ULK1、LC3-B蛋白表达

讨论

GATA6是结直肠癌细胞致瘤的主要调节因子。有研究指出，GATA6能调节LGR5表达，进而促进小鼠形成结肠肿瘤，且在结肠癌组织内，GATA6表达明显上升，远高于结肠正常黏膜。GATA3调控着Th2的发育，在多种恶性肿瘤病人体内，Th2相关细胞因子包括白细胞介素-2、白细胞介素-6等表达均明显增高。GATA3及GATA6与消化道相关脏器肿瘤，包括食道癌、胃癌、结肠癌等的生长密切相关[4]。

本研究将结肠癌HCT116细胞纳为研究材料，利用RNA干扰技术，干扰HCT116细胞GATA3/GATA6后，显示细胞凋亡率较空白对照组明显上升，且在培养时间内，其细胞增殖率明显降低。提示干扰GATA3/GATA6可降低结肠癌细胞增殖率，提高细胞凋亡率，抑制肿瘤生长。

近年来，细胞自噬成为了肿瘤研究的新热点。自噬是生物体内普遍存在的一种现象，且与多种疾病的发生及发展间存在密切关联。目前认为，自噬与肿瘤之间的关系存在双向性，其既能提高肿瘤适应能力，促进恶性细胞增殖，又可诱导肿瘤凋亡，发挥抑癌作用。从大体上来说，癌变的肿瘤自噬能力是下降的，这提示自噬能力降低是利于癌变的[5]。

目前，已发现30多种与自噬相关的基因，LC3-B是自噬的特异性标志物，是其中最为关键的成员。mTOR以及ULK1也是自噬相关基因，ULK1是mTOR激酶的作用底物，mTOR被激活后ULK1被高度磷酸化，多种细胞因子可通过激活mTOR降低细胞自噬能力。本研究发现，干扰GATA3/GATA6后，结肠癌HCT116细胞自噬相关基因LC3-B、mTOR以及ULK1水平均明显低于空白对照组，Western bolt法检测发现，干扰GATA3/GATA6后，结肠癌HCT116细胞自噬相关基因LC3-B、mTOR以及ULK1的蛋白表达水平也明显下降。自噬活性降低则可能激活细胞凋亡程序，进而促进癌细胞凋亡，发挥抑癌作用。

综上所述，干扰GATA3/GATA6可能抑制结肠癌细胞自噬，抑制细胞增殖，增加细胞凋亡，发挥抑癌功效。