贾 娟，王婷婷，侯亚芳

(1.河南工业大学漯河工学院，河南漯河 462002；2.漯河职业技术学院，河南漯河 462002)

蒲公英(Hand.-Mazz.)，别名白鼓丁、黄花地丁、婆婆丁等，是多年生菊科草本植物。蒲公英作为一种药食同源的野生植物，具有很强的环境适应能力，而且种类很丰富，经统计世界上有2 000多种，我国有70多种，广泛分布于各个地区。研究发现，蒲公英中含有多种营养物质，包括蛋白质、脂肪、碳水化合物和一些微量元素，可以用来煲汤、蒸菜、制茶等，对人体有丰富的食用营养价值。除此之外，蒲公英也具有极高的药用价值，早在《唐本草》中就已被提到，其性寒，味甘、苦，归胃、肝经，具有消肿、解毒、散瘀、散热、明目的功效，能用于湿热、喉咙干痛、眼睛肿胀等症的治疗。在现代临床医学上，可用于急性扁桃体炎、胃炎、肝炎、急性结膜炎、淋巴腺炎等疾病的治疗。当前已确定的蒲公英活性成分有黄酮类、多糖类、三萜类、甾醇类、酚酸类和色素类等。国内外大量研究表明，蒲公英具有抑菌活性、抗氧化、抗炎活性、抗肿瘤、调节血脂血糖代谢、提高免疫力、保护胃肠道等作用。

蒲公英中总黄酮的提取方法有回流提取法、超声波提取法、微波提取法等。回流提取法常采用有机溶剂为提取介质，利用加热回流装置进行提取，是一种比较传统的提取工艺，此方法操作较为简单，但提取温度比较高会导致黄酮类化合物损失过多，而且溶剂的用量多、消耗量大，所需的时间长；超声波提取法是通过破坏植物细胞结构，加速溶剂进入细胞，加快细胞内物质的溶出，提高得率，其主要是借用超声波的机械振动作用及空化效应来实现的，在多数情况下，此法比回流法提取节省时间、溶剂使用量少，可减轻温度对提取物的影响，同时应用范围较广，但时间过长会产生一定影响，故需控制适宜的时间；微波提取法主要是通过微波产生的热效应，利用分子因极化而产生的作用及离子的导电效应来实现对物质直接加热，具有高效、快速、操作简单和提取更完全的特点，但需要严格控制时间。近年来，国内外已经出现很多提取蒲公英总黄酮的研究，如董默等、王婧怡等、杨利民等分别采用超声波法、微波法和双水相体系萃取法进行提取，以上的方法多是采用正交试验进行优化，得到的试验数据还不能够完全提供充分的信息，这使得试验结果的准确度存在一定欠缺，特别是同时利用响应面优化并采用超声波和微波2种方法提取蒲公英中总黄酮的研究鲜有报道。为此，该试验分别采用超声波和微波2种方法提取蒲公英总黄酮，利用响应面优化获得最佳的提取工艺条件，并比较分析这2种方法对其提取效果的影响，以合理开发利用蒲公英资源，为今后食品、药品及其他行业研发天然健康的新型产品提供一定的理论基础。

1 材料与方法

蒲公英植株，产地河南漯河；亚硝酸钠、氢氧化钠，分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；硝酸铝，分析纯，广东西陇化工厂；无水乙醇，分析纯，开封市芳晶化学试剂有限公司；芦丁(HPLC≥98%)，北京索莱宝科技有限公司。

LXJ-IIB低速离心机，上海安亭科学仪器厂；DZF-6050 型真空干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；SB-800D超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；FA2004电子天平，上海上平仪器有限公司；FW177高速万能粉碎机，北京市永光明医疗仪器厂；UV-2600紫外可见分光光度计，上海尤尼柯仪器有限公司；EG823LA3-NR美的微波炉，佛山市顺德区美的微波电器制造有限公司；751/722比色皿，无锡新竹光学仪器有限公司。

样品预处理。将自然风干的蒲公英均匀平铺于瓷盘，50 ℃加热，于0.06 MPa的条件下对蒲公英进行烘干至恒重。

2种提取方法单因素优化试验。

超声波法的单因素试验。

(1)液料比。准确称取1.000 0 g的蒲公英粉末8份，分别加入15、25、35、45、55、65、75、85 mL的40%乙醇溶液，提取1次，每次35 min，以4 000 r/min离心20 min，取上清液作为待测液。试验平行3次，观察不同液料比对其得率的影响。

(2)乙醇浓度。准确称取1.000 0 g蒲公英粉末8份，分别加入55 mL不同浓度的乙醇溶液(20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%)，提取1次，每次35 min，以4 000 r/min离心20 min，取上清液作为待测液。试验平行3次，观察不同乙醇浓度对其得率的影响。

(3)提取时间。准确称取1.000 0 g蒲公英粉末8份，均加入25 mL的40%乙醇水溶液，分别超声波提取5、10、15、20、25、30、35、40 min，提取1次，以4 000 r/min离心20 min，取上清液作为待测液。试验平行3次，观察不同提取时间对其得率的影响。

微波法的单因素试验。

(1)液料比。准确称取不同质量的蒲公英粉末6份(0.714 3、0.833 3、1.000 0、1.250 0、1.666 6、2.500 0 g)，均加入50 mL的40%乙醇溶液，即相当于准确称取1.000 0 g蒲公英粉末6份，分别加入20、30、40、50、60、70 mL的40%乙醇溶液，提取1次，每次2 min，以4 000 r/min离心20 min，取上清液作为待测液。试验平行3次，观察不同液料比对其得率的影响。

(2)乙醇浓度。准确称取1.000 0 g蒲公英粉末5份，分别加50 mL不同浓度的乙醇溶液(20%、30%、40%、50%、60%)，提取1次，每次2 min，以4 000 r/min离心20 min，取上清液作为待测液。试验平行3次，观察不同乙醇浓度对其得率的影响。

(3)提取时间。准确称取1.000 0 g蒲公英粉末4份，均加入50 mL的40%乙醇溶液，分别提取1、2、3、4 min，提取1次，以4 000 r/min离心20 min，取上清液作为待测液。试验平行3次，观察不同提取时间对其得率的影响。

2种提取方法响应面优化试验设计。为了获得提取蒲公英中总黄酮的最佳工艺条件，需要研究各影响因素及其水平组合对得率的影响。根据单因素试验结果，选择蒲公英总黄酮的得率(%)为响应值，选取液料比(mL∶g)、乙醇浓度、提取时间为变量。设计3因素3水平试验，见表1。分别设计超声波法和微波法响应面试验的相应因素水平，最后确定2种方法提取蒲公英中总黄酮的最佳工艺参数。

表1 响应面试验因素和水平

响应面验证试验。分别选择超声波提取和微波提取2个方法的最佳工艺条件重复3次试验，进行验证。

最佳提取次数的确定。在最佳条件下分别提取1、2、3次，计算不同提取次数下的总黄酮得率，根据相应得率的百分比，同时考虑能源消耗及试验效率，综合得出最佳的提取次数。

标准曲线的绘制。将20 mg芦丁标准品置于100 mL容量瓶，用60%乙醇稀释定容，即得0.2 mg/mL的标准溶液待用。准确移取0、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL标准溶液于10.00 mL的比色管中，分别加5%亚硝酸钠溶液0.30 mL，摇匀放置6 min后再加入10%硝酸铝溶液0.30 mL，摇匀放置6 min后再加入1 mol/L氢氧化钠溶液4.00 mL，最后用40%乙醇定容至刻度，摇匀放置15 min后，以空白溶液为参比，在波长510 nm处测吸光度。以芦丁标准溶液的不同质量浓度(μg/mL)为横坐标、吸光度为纵坐标作图，得到标准曲线如图1，表明芦丁溶液在0～50 μg/mL线性较好(=0999 5)。根据回归方程计算蒲公英总黄酮浓度，从而得出其得率。

图1 芦丁的标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

蒲公英中总黄酮的测定。准确称取1.000 0 g蒲公英样品粉末于100 mL三角瓶中，加入乙醇溶液，超声波或微波提取后以4 000 r/min离心20 min，取上清液作为待测液。取0.5 mL待测溶液按“..”方法测定样品的吸光度，根据标准曲线计算出浓度，从而得到总黄酮的得率，公式如下：

(1)

式中，为蒲公英总黄酮得率(%)；为经回归方程计算得到的总黄酮浓度(μg/mL)；为提取液的换算总体积(mL)；为蒲公英粉的质量(g)。

采用Excel对试验数据进行整理，通过Design-Expert 8.0.6软件对试验数据及结果进行分析。

2 结果与分析

液料比对蒲公英总黄酮提取效果的影响。从图2可以看出，采用超声波提取时，液料比在15∶1～85∶1，蒲公英总黄酮得率随着液料比的增加先逐渐升高，当液料比为55∶1时得率达到最大，之后再增大液料比，得率则出现逐渐下降的趋势。采用微波提取时，液料比在20∶1～70∶1，蒲公英总黄酮得率随着液料比的增多不断升高，当增加到60∶1时得率达到最大，超过这个液料比之后，蒲公英总黄酮得率下降。

呈现这种变化的原因可能是当液料比较低时，蒲公英不能完全被溶解，这时溶液黏度较大，导致蒲公英中大部分黄酮类物质不能溶出，随着溶剂不断增加，能够增大两者间的接触面积，使其能够充分反应，从而使蒲公英总黄酮得率增加，但当液料比过大时，会导致其他醇溶性成分溶出，影响黄酮类物质的提取，从而导致总黄酮得率下降。故综合考虑，采用超声波提取时，选取液料比为50∶1、55∶1、60∶1为响应面试验的3个水平；采用微波提取时，选取液料比50∶1、60∶1、70∶1为响应面试验的3个水平。

图2 超声波提取法(a)和微波提取法(b)液料比对蒲公英总黄酮提取效果的影响Fig.2 Effect of liquid-solid ratio of ultrasonic extraction method(a)and microwave extraction method(b)on extraction of total flavonoids from Taraxacum mongolicum

乙醇浓度对蒲公英总黄酮提取效果的影响。从图3可以看出，采用超声波提取时，乙醇浓度在20%～90%，蒲公英总黄酮得率随着乙醇浓度的增大先逐渐升高，在乙醇浓度为40%时得率最大，接着趋于平缓，当其超过60%时出现下降趋势，但在80%时得率又稍有增加，之后随着乙醇浓度增大得率直线下降。采用微波提取时，乙醇浓度在20%～60%，蒲公英总黄酮得率随着乙醇浓度的增大先上升，当乙醇浓度为30%时达到最大值，之后逐渐下降。

图3 超声波提取法(a)和微波提取法(b)乙醇浓度对蒲公英总黄酮提取效果的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration of ultrasonic extraction method(a)and microwave extraction method(b)on extraction of total flavonoids from Taraxacum mongolicum

呈现这种趋势的原因主要与黄酮类物质的极性有关，乙醇浓度在30%～40%的极性可能与蒲公英中黄酮类物质的极性相似，蒲公英中其他的醇溶性及脂溶质色素等杂质成分会随着乙醇浓度的增大逐渐溶出，这会对总黄酮得率产生一定影响，色素的产生会对测定造成一定干扰，这些成分也可能会与黄酮类化合物竞争乙醇水分子，从而导致总黄酮得率下降。故综合考虑，采用超声波或微波提取时，均可选取乙醇浓度30%、40%、50%为响应面试验的3个水平。

提取时间对蒲公英总黄酮提取效果的影响。从图4可以看出，采用超声波提取时，在提取时间为5～40 min，随着提取时间的延长，蒲公英总黄酮得率逐渐升高，在35 min时得率最大，之后出现下降的趋势。采用微波提取时，在提取时间为1～4 min，蒲公英总黄酮得率随着微波时间的延长逐渐升高，在时间为3 min时得率最大，当超过这个时间后，蒲公英总黄酮得率下降。

呈现这种趋势的原因可能是随着提取时间延长，蒲公英总黄酮能够充分与溶剂接触，使其逐渐溶出，得率升高，但当达到一定时间，总黄酮溶出完全时，若再延长提取时间，则会导致其他非黄酮类物质溶出，使得率下降。同时超声波和微波炉产生的热效应可能会破坏黄酮类物质，从而导致蒲公英总黄酮得率下降。故综合考虑，选取超声时间30、35、40 min为响应面试验的3个水平，选取微波时间响应面试验的3个水平为2、3、4 min。

图4 超声波提取法(a)和微波提取法(b)提取时间对蒲公英总黄酮提取效果的影响Fig.4 Effect of extraction time of ultrasonic extraction method(a)and microwave extraction method(b)on extraction of total flavonoids from Taraxacum mongolicum

选取液料比(A)、乙醇浓度(B)、提取时间(C)为变量，超声波提取法和微波提取法蒲公英总黄酮得率分别为响应值和。利用Design-Expert 8.0.6软件来设计响应面试验(表2)，以优化提取工艺。

表2 响应面试验设计及结果

超声波提取法的响应面方差分析。通过对表2中的数据进行拟合分析，从而获得蒲公英总黄酮得率的二次多项回归方程，即=1908+001+0016 25+0046 25-0005-003+0037 5-0180 25-0122 75-0052 75。超声波提取法响应面方差分析见表3，从表3可以看出此模型极显著(<0001)，同时失拟项不显著(=0.861 3>0.05)，这表明此模型结果可靠，故能够利用该模型来确定蒲公英总黄酮的最佳提取工艺。从表3可以看出3个因素对总黄酮得率的影响，在一次项中C影响极显著(<0.001)，B影响很显著(<0.01)，A影响显著(<0.05)，二次项影响均极显著(<0.001)，交互项中只有AB影响不显著(>0.05)，其余影响均极显著(<0.001)。各因素对响应值的影响可以由值来反映，即值越小，表明影响越大。由此可得出，影响超声波提取蒲公英总黄酮因素的主次关系是C>B>A，即提取时间>乙醇浓度>液料比。

微波提取法的响应面方差分析。通过对表2中的数据进行拟合分析，从而获得蒲公英总黄酮得率的二次多项回归方程，即=239+0079′-0049′+0040′+0007 5′′-011′′-0030′′-0083′-016′-0065′。微波提取法响应面方差分析见表4，从表4可以看出此模型极显著(<0001)，同时失拟项不显著(=0.862 6>0.05)，这表明此模型结果可靠，故能够利用该模型来确定蒲公英总黄酮的最佳提取工艺。从表4可以看出，3个因素对总黄酮得率的影响，在一次项中A′和B′影响均极显著(<0.001)，C′影响很显著(<0.01)，二次项影响均极显著(<0.001)，交互项中只有A′B′影响不显著(>0.05)，A′C′影响极显著(<0.001)，B′C′影响显著(<0.05)。各因素对响应值的影响可以由值来反映，即值越小，表明影响越大。由此可得出，影响微波提取蒲公英总黄酮因素的主次关系是A′>B′>C′，即液料比>乙醇浓度>提取时间。

最佳工艺条件的验证。通过响应面模型的预测，超声法得到最佳工艺条件为液料比54.92∶1、乙醇浓度41.43%、提取时间37.47 min，此条件下的蒲公英总黄酮的理论得率为1.920 5%；微波法得到最佳工艺条件为液料比65.62∶1、乙醇浓度38.72%、提取时间2.86 min，在此条件下的蒲公英总黄酮的理论得率为2.410 5%。考虑到试验的实际操作，超声波提取法和微波提取法进行取整微调分别为液料比55∶1、乙醇浓度40%、提取时间37 min；液料比65∶1、乙醇浓度40%、提取时间3 min，在此条件下进行验证试验，测得的蒲公英总黄酮的平均得率分别为1.912 1%和2.406 6%，与理论值很接近，这表明这2种方法经响应面优化得到的蒲公英总黄酮的最佳提取工艺是可行的。

表3 超声波提取法的响应面方差分析

表4 微波提取法响应面方差分析

最佳提取次数的确定。在最佳提取工艺的条件下，确定提取次数，结果见表5。由表5可知，超声波提取法和微波提取法提取1次时总黄酮得率占比分别达到81.3%和 89.4%，当对其提取2次时总黄酮得率占比分别达到94.6%和98.2%，故综合多方面考虑，提取1次较为合适，节省时间的同时也降低了成本；但若要求更高得率，提取2次更为合适，不过在充分考虑成本及效率的情况下，提取1次为最佳。

不同因素影响程度的比较。综上所述，不同提取方法对同一因素的影响程度是不同的，采用超声波提取时最主要的影响因素是提取时间，而微波提取时最主要影响因素是液料比，这可能与其相应的原理有一定关系，可能超声时间对蒲公英总黄酮得率的影响较大，由其相应的单因素及响应面试验可见，随着超声时间的变化，得率变化较大；而微波提取时，可能是因为微波热效应对液料比的影响较大，能够使内部物质发生一定程度的变化，对其得率有更大影响。

表5 2种提取方法提取次数对总黄酮得率的影响

总黄酮平均得率的比较。采用2种方法对蒲公英总黄酮进行提取，经响应面优化得到最佳提取工艺，进行3次重复试验，以验证最佳工艺。从验证试验的结果中可知，采用微波法提取蒲公英总黄酮得率相对较高，故仅从得率方面来看，微波法提取效果较好。

在不同提取次数下的比较。在最佳条件下，分别用这2种提取方法对蒲公英总黄酮提取不同次数，以确定最佳提取次数，两者的比较见表5。由表5可知，随着提取次数的增加，总黄酮得率在逐渐升高，但无论是提取单次还是多次，利用微波提取时，蒲公英总黄酮得率较高，这可能与其各自的原理有关，超声波是属于由外至内的作用，利用其空化效应及机械振动来实现，而微波是使其内部物质受热，以加快溶剂进入。故相比较而言，微波法提取更为快速，提取更为完全。

3 结论

该试验主要研究超声波和微波2种方法对蒲公英中总黄酮提取效果的影响，结果表明，超声波提取法，在液料比55∶1、乙醇浓度40%、提取时间37 min的条件下，提取1次，蒲公英总黄酮平均得率为1.912 1%。微波提取法，在液料比65∶1、乙醇浓度40%、提取时间3 min的条件下，提取1次，蒲公英总黄酮平均得率为2.406 6%。

从以上试验数据中比较分析2种方法，各有利弊，综合分析来看，提取蒲公英总黄酮微波法比超声波法效果较好。从影响因素来看，2种方法提取时最主要的影响因素有所不同，可以根据试验成本及提取目的来选择更为合适的方法；从提取效率和能源消耗方面来分析，微波法提取用时短、效率高、节约能源；从得率的角度来看，微波法提取时蒲公英总黄酮得率较高；但微波法使用的液料比相对于超声波法提取较高些。综合多种因素来考虑，微波法提取效果较好，总黄酮得率较高。这将为今后蒲公英产品的研发提供一定参考，也为食品及制药工业开发新型健康天然的产品提供相关理论基础。